Спасибо за посещение сайта Nature.com. Версия используемого вами браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для достижения наилучших результатов мы рекомендуем использовать более новую версию вашего браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы отображаем сайт без стилей и JavaScript.
Рост микроорганизмов в ранах часто проявляется в виде биопленок, которые препятствуют заживлению и трудно поддаются удалению. Новые серебряные повязки, как утверждается, борются с инфекциями ран, но их антибиопленочная эффективность и независимые от инфекции эффекты заживления, как правило, неизвестны. Используя модели биопленок Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa in vitro и in vivo, мы сообщаем об эффективности повязок, генерирующих ионы Ag1+; повязок Ag1+, содержащих этилендиаминтетрауксусную кислоту и бензетонийхлорид (Ag1+/EDTA/BC), и повязок, содержащих нитрат серебра (оксисоли Ag), которые продуцируют ионы Ag1+, Ag2+ и Ag3+ для борьбы с биопленкой в ране и ее влияния на заживление. Повязки Ag1+ оказывали минимальное воздействие на биопленку в ране in vitro и у мышей (C57BL/6j). Напротив, оксигенированные соли серебра и повязки Ag1+/EDTA/BC значительно снижали количество жизнеспособных бактерий в биопленках in vitro и демонстрировали значительное снижение бактериальных и внеклеточных компонентов в биопленках ран у мышей. Эти повязки оказывали различное воздействие на заживление ран, инфицированных биопленками, и ран, не инфицированных биопленками, при этом повязки с оксигенированными солями оказывали более благоприятное воздействие на реэпителизацию, размер раны и воспаление по сравнению с контрольными методами лечения и другими серебряными повязками. Различные физико-химические свойства серебряных повязок могут по-разному влиять на биопленку раны и заживление, и это следует учитывать при выборе повязки для лечения ран, инфицированных биопленками.
Хронические раны определяются как «раны, которые не проходят нормальные стадии заживления упорядоченным и своевременным образом»¹. Хронические раны создают психологическое, социальное и экономическое бремя для пациентов и системы здравоохранения. Ежегодные расходы Национальной службы здравоохранения Великобритании на лечение ран и связанных с ними сопутствующих заболеваний оцениваются в 8,3 миллиарда фунтов стерлингов в 2017–2018 годах². Хронические раны также являются в настоящее время актуальной проблемой в Соединенных Штатах, где, по оценкам Medicare, ежегодные затраты на лечение пациентов с ранами составляют от 28,1 до 96,8 миллиардов долларов³.
Инфекция является основным фактором, препятствующим заживлению ран. Инфекции часто проявляются в виде биопленок, которые присутствуют в 78% незаживающих хронических ран. Биопленки образуются, когда микроорганизмы необратимо прикрепляются к поверхностям, таким как поверхности ран, и могут агрегироваться, образуя сообщества, продуцирующие внеклеточные полимеры (ВПП). Раневая биопленка связана с усилением воспалительной реакции, приводящей к повреждению тканей, что может замедлить или предотвратить заживление4. Увеличение повреждения тканей может быть частично обусловлено повышенной активностью матриксных металлопротеиназ, коллагеназы, эластазы и активных форм кислорода5. Кроме того, воспалительные клетки и биопленки сами по себе являются большими потребителями кислорода и, следовательно, могут вызывать локальную гипоксию тканей, истощая клетки жизненно важным кислородом, необходимым для эффективного восстановления тканей6.
Зрелые биопленки обладают высокой устойчивостью к противомикробным препаратам, что требует применения агрессивных стратегий для борьбы с биопленочными инфекциями, таких как механическая обработка с последующим эффективным противомикробным лечением. Поскольку биопленки способны быстро регенерировать, эффективные противомикробные препараты могут снизить риск повторного образования после хирургической обработки7.
Серебро все чаще используется в антимикробных повязках и часто применяется в качестве средства первой линии лечения хронических инфицированных ран. На рынке представлено множество серебряных повязок, каждая из которых содержит различное количество серебра, его концентрацию и базовую матрицу. Развитие серебряных браслетов привело к разработке новых типов браслетов. Металлическая форма серебра (Ag0) инертна; для достижения антимикробной эффективности она должна потерять электрон, образуя ион серебра (Ag1+). Традиционные серебряные повязки содержат соединения серебра или металлическое серебро, которые при контакте с жидкостью разлагаются, образуя ионы Ag1+. Эти ионы Ag1+ реагируют с бактериальной клеткой, отнимая электроны у структурных компонентов или критически важных процессов, необходимых для выживания. Запатентованная технология привела к разработке нового соединения серебра, оксисолей серебра (нитрат серебра, Ag7NO11), которое входит в состав раневых повязок. В отличие от традиционного серебра, разложение кислородсодержащих солей приводит к образованию состояний серебра с более высокой валентностью (Ag1+, Ag2+ и Ag3+). Исследования in vitro показали, что низкие концентрации оксигенированных солей серебра более эффективны, чем серебро с одним ионом (Ag1+), против патогенных бактерий, таких как Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Escherichia coli8,9. Другой новый тип серебряных повязок включает дополнительные ингредиенты, а именно этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и бензетония хлорид (БК), которые, как сообщается, воздействуют на внеклеточный полимерный материал биопленки и тем самым увеличивают проникновение серебра в биопленку. Эти новые серебряные технологии предлагают новые способы воздействия на раневые биопленки. Однако важно оценить влияние этих антимикробных средств на среду раны и заживление, не зависящее от инфекции, чтобы убедиться, что они не создают неблагоприятную среду в ране и не замедляют заживление. Сообщалось об опасениях по поводу цитотоксичности серебра in vitro в отношении нескольких серебряных повязок10,11. Однако цитотоксичность in vitro еще не подтвердилась в исследованиях in vivo, и несколько повязок с Ag1+ продемонстрировали хороший профиль безопасности12.
В данном исследовании мы изучили эффективность повязок из карбоксиметилцеллюлозы, содержащих новые составы серебра, против раневой биопленки in vitro и in vivo. Кроме того, была оценена эффективность этих повязок в отношении иммунного ответа и заживления ран независимо от инфекции.
Все использованные повязки были доступны в продаже. В качестве контрольной повязки в этом исследовании использовалась гелевая фибровая повязка 3M Kerracel (3M, Натсфорд, Великобритания), не обладающая антимикробными свойствами, состоящая на 100% из карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ). Были оценены три антимикробные серебряные повязки на основе КМЦ, а именно повязка 3M Kerracel Ag (3M, Натсфорд, Великобритания), содержащая 1,7 мас.% кислородсодержащей соли серебра (Ag7NO11) в виде ионов серебра с более высокой валентностью (Ag1+, Ag2+ и Ag3+). При разложении Ag7NO11 ионы Ag1+, Ag2+ и Ag3+ образуются в соотношении 1:2:4. Повязка Aquacel Ag Extra, содержащая 1,2% хлорида серебра (Ag1+) (ConvaTec, Дисайд, Великобритания) 13 и повязка Aquacel Ag + Extra, содержащая 1,2% хлорида серебра (Ag1+), ЭДТА и бензетония хлорид (ConvaTec, Дисайд, Великобритания) 14.
В данном исследовании использовались штаммы Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Солсбери) и Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Солсбери).
Бактерии выращивали в течение ночи в бульоне Мюллера-Хинтона (Oxoid, Альтринчем, Великобритания). Затем ночную культуру разбавляли в соотношении 1:100 в бульоне Мюллера-Хинтона, и 200 мкл высевали на стерильные циклопоровые мембраны Whatman с порами 0,2 мкм (Whatman plc, Мейдстон, Великобритания) на чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтона (Sigma-Aldrich Company Ltd, Кент, Великобритания). Формирование колониальной биопленки проводили при 37°C в течение 24 часов. Эти колониальные биопленки тестировали на логарифмическую усадку.
Разрежьте повязку на квадратные кусочки размером 3 см² и предварительно смочите стерильной деионизированной водой. Наложите повязку на биопленку колонии на агаровой пластине. Каждые 24 га биопленки удаляли, и количество жизнеспособных бактерий в биопленке (КОЕ/мл) определяли методом серийных разведений (от 10⁻¹ до 10⁻⁷) в нейтрализующем бульоне Дей-Энгля (Merck-Millipore). После 24 часов инкубации при 37°C проводили стандартный подсчет колоний на агаровых пластинах Мюллера-Хинтона. Каждый вариант обработки и временная точка выполнялись в трех повторениях, и подсчет колоний повторяли для каждого разведения.
Свиная грудинка изготавливалась из брюшины самок свиней породы Large White в течение 15 минут после убоя в соответствии со стандартами экспорта Европейского союза. Кожа была очищена спиртовыми салфетками, затем заморожена при -80°C на 24 часа для девитализации. После размораживания кусочки кожи площадью 1 см² трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), 0,6% раствором гипохлорита натрия и 70% этанолом в течение 20 минут каждый раз. Перед удалением эпидермиса остатки этанола удаляли, промывая кожу 3 раза стерильным PBS. Культивирование кожи проводили в 6-луночном планшете с нейлоновой мембраной толщиной 0,45 мкм (Merck-Millipore) сверху и 3 абсорбирующими подушечками (Merck-Millipore), содержащими 3 мл фетальной бычьей сыворотки (Sigma) с добавлением 10% модифицированной среды Игла Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Колониальные биопленки выращивали, как описано для исследований воздействия биопленок. После культивирования биопленки на мембране в течение 72 часов биопленку наносили на поверхность кожи с помощью стерильной инокуляционной петли, после чего мембрану удаляли. Затем биопленку инкубировали на дерме свиньи еще 24 часа при 37°C, чтобы она созрела и прикрепилась к коже свиньи. После созревания и прикрепления биопленки на поверхность кожи наносили повязку площадью 1,5 см², предварительно смоченную стерильной дистиллированной водой, и инкубировали при 37°C в течение 24 часов. Жизнеспособные бактерии визуализировали путем окрашивания, равномерно нанося реагент для определения жизнеспособности клеток PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Великобритания) на апикальную поверхность каждого экспланта и инкубируя в течение 5 минут. Используйте цифровую камеру Leica DFC425 для мгновенного получения изображений на микроскопе Leica MZ8. Области, окрашенные в розовый цвет, были количественно оценены с помощью программного обеспечения Image Pro версии 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). Сканирующая электронная микроскопия проводилась, как описано ниже.
Бактерии, выращенные в течение ночи, разбавляли в соотношении 1:100 в бульоне Мюллера-Хинтона. 200 мкл культуры добавляли на стерильную циклопоровую мембрану Whatman с порами 0,2 мкм (Whatman, Мейдстон, Великобритания) и высевали на агар Мюллера-Хинтона. Чашки с биопленкой инкубировали при 37°C в течение 72 часов для образования зрелой биопленки.
После 3 дней созревания биопленки на нее накладывали квадратную повязку размером 3 см² и инкубировали при температуре 37°C в течение 24 часов. После снятия повязки с поверхности биопленки на каждую биопленку наносили 1 мл реагента PrestoBlue Cell Viability Reagent (Invitrogen, Waltham, MA) на 20 секунд. Поверхности высушивали, после чего изменения цвета регистрировали с помощью цифровой камеры Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, UK).
Подготовьте ночные культуры на агаре Мюллера-Хинтона, перенесите отдельные колонии в 10 мл бульона Мюллера-Хинтона и инкубируйте на шейкере при 37°C (100 об/мин). После ночной инкубации культуру разбавили в соотношении 1:100 в бульоне Мюллера-Хинтона, и 300 мкл нанесли на круглую мембрану Whatman Cyclopore 0,2 мкм (Whatman International, Мейдстон, Великобритания) на агаре Мюллера-Хинтона и инкубировали при 37°C в течение 72 часов. Зрелую биопленку нанесли на рану, как описано ниже.
Все работы с животными проводились в Манчестерском университете в рамках проектной лицензии, утвержденной Управлением по защите животных и этической экспертизе (P8721BD27), и в соответствии с руководящими принципами, опубликованными Министерством внутренних дел в рамках пересмотренного ASPA 2012 года. Все авторы соблюдали правила прибытия животных. Для всех исследований in vivo использовались восьминедельные мыши C57BL/6j (Envigo, Оксон, Великобритания). Мышей анестезировали изофлураном (Piramal Critical Care Ltd, Вест-Дрейтон, Великобритания), их спинные поверхности брили и очищали. Затем каждой мыши наносили эксцизионную рану размером 2 × 6 мм с помощью биопсийного пробойника Штифеля (Schuco International, Хартфордшир, Великобритания). Для ран, инфицированных биопленкой, наносили 72-часовую колониальную биопленку, выращенную на мембране, как описано выше, на дермальный слой раны с помощью стерильной инокуляционной петли сразу после травмы и удаляли мембрану. Один квадратный сантиметр повязки предварительно увлажняли стерильной водой для поддержания влажной среды в ране. Повязки накладывали непосредственно на каждую рану и покрывали пленкой 3M Tegaderm (3M, Бракнелл, Великобритания), а по краям наносили жидкий клей Mastisol (Eloquest Healthcare, Ферндейл, Мичиган) для дополнительной адгезии. В качестве анальгетика вводили бупренорфин (Animalcare, Йорк, Великобритания) в концентрации 0,1 мг/кг. Через три дня после травмы мышей умерщвляли, используя метод Списка 1, а раневую область удаляли, разрезали пополам и хранили по мере необходимости.
Окрашивание гематоксилином (ThermoFisher Scientific) и эозином (ThermoFisher Scientific) проводилось в соответствии с протоколом производителя. Площадь раны и степень реэпителизации количественно оценивались с помощью программного обеспечения Image Pro версии 10 (Media Cybernetics Inc, Роквилл, Мэриленд).
Срезы тканей депарафинировали в ксилоле (ThermoFisher Scientific, Лафборо, Великобритания), регидратировали 100–50%-ным раствором этанола и кратковременно погружали в деионизированную воду (ThermoFisher Scientific). Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием набора VectaStain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Берлингем, Калифорния) в соответствии с протоколом производителя. Первичные антитела к нейтрофилам NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) и макрофагам Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Уокингем, Великобритания) разводили в соотношении 1:100 в блокирующем растворе и наносили на срез, затем добавляли 2 антитела Anti-, VectaStain ABC и субстрат Vector Nova Red Peroxidase (HRP) (Vector Laboratories, Берлингем, Калифорния) и докрашивали гематоксилином. Изображения были получены с помощью микроскопа Olympus BX43 и цифровой камеры Olympus DP73 (Olympus, Саутенд-он-Си, Великобритания).
Образцы кожи фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида и 4% растворе формальдегида в 0,1 М HEPES (pH 7,4) в течение 24 часов при 4°C. Образцы обезвоживали с помощью этанола различной концентрации и высушивали в CO2 с использованием сушилки критической точки Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Лафтон, Великобритания), а затем наносили методом магнетронного распыления сплав золота и палладия с помощью мини-распылителя/системы тлеющего разряда Quorum SC7620. Изображения образцов получали с помощью сканирующего электронного микроскопа FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) для визуализации центральной точки раны.
Йодид Тото-1 (2 мкМ) наносили на поверхность иссеченной раны у мышей и инкубировали в течение 5 минут при 37 °C (ThermoFisher Scientific), после чего обрабатывали Сито-60 (10 мкМ) при 37 °C (ThermoFisher Scientific). Изображения Z-стека с интервалом в 15 минут создавали с помощью микроскопа Leica TCS SP8.
Биологические и технические данные повторных измерений были сведены в таблицы и проанализированы с помощью программного обеспечения Graphpad Prism V9 (GraphPad Software, Ла-Холья, Калифорния). Для проверки различий между каждым вариантом лечения и контрольной повязкой без антимикробных добавок использовался однофакторный дисперсионный анализ с множественными сравнениями с применением апостериорного теста Даннетта. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым.
Эффективность волокнистых повязок с серебряным гелем была впервые оценена in vitro на биопленочных колониях Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. Серебряные повязки содержат различные формулы серебра: традиционные серебряные повязки продуцируют ионы Ag1+; серебряные повязки, которые могут продуцировать ионы Ag1+ после добавления ЭДТА/БК, могут разрушать матрицу биопленки и подвергать бактерии воздействию серебра под антибактериальным действием серебра.15 и повязки, содержащие кислородсодержащие соли серебра, продуцируют ионы Ag1+, Ag2+ и Ag3+. Их эффективность сравнивали с контрольной неантимикробной повязкой из гелевых волокон. Остаток жизнеспособных бактерий в биопленке оценивали каждые 24 часа в течение 8 дней (Рисунок 1). На 5-й день биопленку повторно инокулировали 3,85 × 10⁵S. Staphylococcus aureus или 1,22 × 10⁵P. aeruginosa для оценки восстановления биопленки. По сравнению с контрольными повязками без антимикробных свойств, повязки с Ag1+ оказывали минимальное воздействие на жизнеспособность бактерий в биопленках Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa в течение 5 дней. В противоположность этому, повязки, содержащие оксигенированное серебро и соли Ag1+ + ЭДТА/БК, эффективно уничтожали бактерии в биопленке в течение 5 дней. После повторного введения планктонных бактерий на 5-й день восстановления биопленки не наблюдалось (рис. 1).
Количественная оценка жизнеспособных бактерий в биопленках Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa после обработки серебряными повязками. Колонии биопленок Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa обрабатывали серебряными повязками или контрольными повязками без антимикробных свойств, и количество оставшихся жизнеспособных бактерий определяли каждые 24 часа. Через 5 дней биопленку повторно инокулировали 3,85×10⁵S Staphylococcus aureus или 1,22×10⁵P. Для оценки восстановления биопленки формировали отдельные колонии бактериопланктона Pseudomonas aeruginosa. Графики показывают среднее значение +/- стандартную ошибку.
Для визуализации влияния серебряных повязок на жизнеспособность биопленки, повязки наносили на зрелые биопленки, выращенные на свиной коже ex vivo. Через 24 часа повязку снимали, и биопленку окрашивали синим реактивным красителем, который метаболизировался живыми бактериями, придавая ей розовый цвет. Биопленки, обработанные контрольными повязками, были розовыми, что указывало на присутствие жизнеспособных бактерий внутри биопленки (рис. 2А). В отличие от этого, биопленка, обработанная повязкой с оксизолями серебра, была преимущественно синей, что указывало на то, что оставшиеся бактерии на поверхности свиной кожи были нежизнеспособными (рис. 2В). Смешанная сине-розовая окраска наблюдалась в биопленках, обработанных повязками, содержащими Ag1+, что указывало на присутствие жизнеспособных и нежизнеспособных бактерий внутри биопленки (рис. 2С), тогда как повязки ЭДТА/БК, содержащие Ag1+, были преимущественно синими с некоторыми розовыми пятнами, указывающими на области, не затронутые серебряной повязкой (рис. 2D). Количественная оценка активных (розовых) и неактивных (синих) участков показала, что контрольный пластырь был активен на 75% (рис. 2E). Повязки Ag1+ + EDTA/BC показали аналогичные результаты, как и повязки с оксигенированными солями серебра, с показателями выживаемости 13% и 14% соответственно. Повязка Ag1+ также снизила жизнеспособность бактерий на 21%. Затем эти биопленки были исследованы с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). После обработки контрольной повязкой и повязкой Ag1+ наблюдался слой Pseudomonas aeruginosa, покрывающий свиную кожу (рис. 2F,H), тогда как после обработки повязкой Ag1+ было обнаружено небольшое количество бактериальных клеток, и небольшое количество бактериальных клеток находилось под ними. Коллагеновые волокна можно рассматривать как тканевую структуру свиной кожи (рис. 2G). После обработки повязкой Ag1+ + EDTA/BC были видны бактериальные бляшки и под ними бляшки из коллагеновых волокон (рис. 2I).
Визуализация биопленки Pseudomonas aeruginosa после обработки серебряной повязкой. (A–D) Жизнеспособность бактерий в биопленках Pseudomonas aeruginosa, выращенных на свиной коже, визуализировали с помощью красителя PrestoBlue через 24 часа после обработки серебряными повязками или контрольными повязками без антимикробных свойств. Живые бактерии обозначены розовым цветом, нежизнеспособные бактерии и свиная кожа — синим. (E) Количественная оценка биопленок Pseudomonas aeruginosa, выращенных на свиной коже (розовое пятно), с использованием сканирующей электронной микроскопии Image Pro версии 10 (FI) и обработанных серебряной повязкой или контрольной повязкой без антимикробных свойств в течение 24 часов. Масштабная линейка SEM = 5 мкм. (J–M) Колониальные биопленки, выращенные на фильтрах, были окрашены реактивным красителем PrestoBlue после 24 часов инкубации с серебряными повязками.
Чтобы определить, влияет ли тесный контакт повязок с биопленками на их эффективность, колониальные биопленки, помещенные на плоскую поверхность, обрабатывали повязками в течение 24 часов, а затем окрашивали реактивными красителями. Необработанная биопленка имела темно-розовый цвет (рис. 2J). В отличие от биопленок, обработанных повязками, содержащими оксигенированные соли серебра (рис. 2K), биопленки, обработанные повязками, содержащими Ag1+ или Ag1+ + EDTA/BC, демонстрировали полосы розового окрашивания (рис. 2L,M). Эта розовая окраска указывает на наличие жизнеспособных бактерий и связана с областью шва внутри повязки. Эти зашитые участки создают мертвые пространства, которые позволяют бактериям внутри биопленки выживать.
Для оценки эффективности серебряных повязок in vivo, иссеченные раны на всю толщину кожи мышей, инфицированных зрелыми биопленками S. aureus и P. aeruginosa, обрабатывали контрольными повязками без антимикробных свойств или серебряными повязками. После 3 дней лечения макроскопический анализ изображений показал меньшие размеры ран при обработке повязками с оксигенированными солями по сравнению с контрольными повязками без антимикробных свойств и другими серебряными повязками (рис. 3A-H). Для подтверждения этих наблюдений раны были извлечены, а площадь раны и реэпителизация были количественно оценены на срезах тканей, окрашенных гематоксилином и эозином, с использованием программного обеспечения ImagePro версии 10 (рис. 3I-L).
Влияние серебряных повязок на поверхность раны и реэпителизацию ран, инфицированных биопленками. (A–H) Мелкие клетки, инфицированные биопленками Pseudomonas aeruginosa (A–D) и Staphylococcus aureus (E–H) после трех дней лечения неантимикробной контрольной повязкой, повязкой с оксигенированной солью серебра, повязкой Ag1+ и повязкой Ag1+. Репрезентативные макроскопические изображения ран мышей с повязкой Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Репрезентативные гистологические срезы инфекции Pseudomonas aeruginosa, окрашенные гематоксилином и эозином, используемые для количественной оценки площади раны и регенерации эпителия. Количественная оценка площади раны (M, O) и процент реэпителизации (N, P) ран, инфицированных биопленками Pseudomonas aeruginosa (M, N) и Staphylococcus aureus (O, P) (в каждой группе лечения n = 12). На графиках показано среднее значение +/- стандартная ошибка. * означает p = < 0,05 ** означает p = < 0,01; Макроскопический масштаб = 2,5 мм, гистологический масштаб = 500 мкм.
Количественная оценка площади ран, инфицированных биопленкой Pseudomonas aeruginosa (рис. 3M), показала, что раны, обработанные оксисолями серебра, имели средний размер 2,5 мм², в то время как рана, обработанная контрольной повязкой без антимикробных добавок, имела средний размер 3,1 мм², что не соответствует действительности. (рис. 3M). p = 0,423). Раны, обработанные Ag1+ или Ag1+ + EDTA/BC, не показали уменьшения площади раны (3,1 мм² и 3,6 мм² соответственно). Лечение оксигенированной повязкой с солью серебра способствовало реэпителизации в большей степени, чем контрольная повязка без антимикробных добавок (34% и 15% соответственно; p = 0,029) и Ag1+ или Ag1+ + EDTA/BC (10% и 11%) (рис. 3N).
Аналогичные тенденции в площади раны и регенерации эпителия наблюдались в ранах, инфицированных биопленками S. aureus (рис. 3O). Повязки, содержащие оксигенированные соли серебра, уменьшили площадь раны (2,0 мм²) на 23% по сравнению с контрольной неантимикробной повязкой (2,6 мм²), хотя это уменьшение не было статистически значимым (p = 0,304) (рис. 3O). Кроме того, площадь раны в группе лечения Ag1+ была незначительно уменьшена (2,4 мм²), в то время как рана, обработанная повязкой Ag1+ + EDTA/BC, не уменьшила площадь раны (2,9 мм²). Кислородные соли серебра также способствовали реэпителизации ран, инфицированных биопленкой S. aureus (31%), в большей степени, чем раны, обработанные контрольными неантимикробными повязками (12%, p = 0,003) (рис. 3P). Повязка Ag1+ (16%, p = 0,903) и повязка Ag+1 + EDTA/BC (14%, p = 0,965) показали уровни регенерации эпителия, аналогичные контрольным.
Для визуализации влияния серебряных повязок на матрицу биопленки было проведено окрашивание йодидом Тото 1 и Сито 60 (рис. 4). Йодид Тото 1 — это непроницаемый для клеток краситель, который можно использовать для точной визуализации внеклеточных нуклеиновых кислот, которые в большом количестве присутствуют в ЭПС биопленок. Сито 60 — это проникающий в клетки краситель, используемый в качестве контрастного красителя16. Наблюдения с использованием йодида Тото 1 и Сито 60 в ранах, инокулированных биопленками Pseudomonas aeruginosa (рис. 4A-D) и Staphylococcus aureus (рис. 4I-L), показали, что после 3 дней лечения повязками количество ЭПС в биопленке значительно уменьшилось. Повязки Ag1+ без дополнительных антибиопленочных компонентов значительно снижали количество внеклеточной ДНК в ранах, инокулированных Pseudomonas aeruginosa, но были менее эффективны в ранах, инокулированных Staphylococcus aureus.
Прижизненная визуализация раневой биопленки после 3 дней лечения контрольными или серебряными повязками. Конфокальные изображения Pseudomonas aeruginosa (A–D) и Staphylococcus aureus (I–L), окрашенных Toto 1 (зеленый) для визуализации внеклеточных нуклеиновых кислот, компонента внеклеточных полимеров биопленки. Для окрашивания внутриклеточных нуклеиновых кислот используйте Syto 60 (красный). P. Сканирующая электронная микроскопия ран, инфицированных биопленками Pseudomonas aeruginosa (E–H) и Staphylococcus aureus (M–P) после 3 дней лечения контрольными и серебряными повязками. Масштабная линейка СЭМ = 5 мкм. Масштабная линейка конфокальной микроскопии = 50 мкм.
Сканирующая электронная микроскопия показала, что у мышей, инокулированных биопленочными колониями Pseudomonas aeruginosa (рис. 4E-H) и Staphylococcus aureus (рис. 4M-P), после 3 дней лечения всеми видами серебряных повязок в ранах наблюдалось значительно меньше бактерий.
Для оценки влияния серебряных повязок на воспаление ран у мышей, инфицированных биопленкой, срезы ран, инфицированных биопленкой и обработанных контрольными или серебряными повязками в течение 3 дней, были окрашены иммуногистохимическим методом с использованием антител, специфичных для нейтрофилов и макрофагов. Количественное определение нейтрофилов и макрофагов внутри грануляционной ткани. Рисунок 5). Все серебряные повязки снижали количество нейтрофилов и макрофагов в ранах, инфицированных Pseudomonas aeruginosa, по сравнению с контрольными повязками без антимикробных свойств после трех дней лечения. Однако лечение повязкой с оксигенированной солью серебра привело к большему снижению количества нейтрофилов (p = <0,0001) и макрофагов (p = <0,0001) по сравнению с другими протестированными серебряными повязками (Рисунок 5I,J). Хотя Ag1+ + EDTA/BC оказывало большее влияние на раневую биопленку, оно снижало уровни нейтрофилов и макрофагов в меньшей степени, чем повязка Ag1+. Умеренное инфицирование ран биопленкой S. aureus также наблюдалось после повязки с оксисолами Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) и Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) по сравнению с контролем. Аналогичные тенденции наблюдаются и в отношении нейтропении. (Рис. 5K). Однако только повязка с оксигенированными солями Ag показала значительное снижение количества макрофагов в грануляционной ткани по сравнению с контролем в ранах, инфицированных биопленками S. aureus (p = 0,0339) (Рис. 5L).
Количественная оценка нейтрофилов и макрофагов проводилась в ранах, инфицированных биопленками Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, после 3 дней лечения контрольными повязками без антимикробных препаратов или серебряными повязками. Нейтрофилы (AD) и макрофаги (EH) количественно оценивались в срезах тканей, окрашенных антителами, специфичными для нейтрофилов или макрофагов. Количественная оценка нейтрофилов (I и K) и макрофагов (J и L) в ранах, инфицированных биопленками Pseudomonas aeruginosa (I и J) и Staphylococcus aureus (K и L). N = 12 в каждой группе. На графиках показаны средние значения +/- стандартная ошибка, значения значимости по сравнению с контрольной повязкой без антимикробных препаратов, * означает p = < 0,05, ** означает p = < 0,01; *** означает p = < 0,001; указывает на p = < 0,0001).
Затем мы оценили влияние серебряных повязок на заживление, не зависящее от инфекции. Неинфицированные эксцизионные раны обрабатывали контрольной повязкой без антимикробных свойств или серебряной повязкой в течение 3 дней (Рисунок 6). Среди протестированных серебряных повязок только раны, обработанные повязкой с оксигенированными солями, выглядели меньше на макроскопических изображениях, чем раны, обработанные контрольной повязкой (Рисунок 6A-D). Количественная оценка площади раны с помощью гистологического анализа показала, что средняя площадь раны после обработки повязкой с оксизолями серебра составляла 2,35 мм² по сравнению с 2,96 мм² для ран, обработанных контрольной группой, но эта разница не достигла статистической значимости (p = 0,488) (Рис. 6I). В отличие от этого, уменьшения площади раны не наблюдалось после обработки повязками Ag1+ (3,38 мм², p = 0,757) или Ag1+ + EDTA/BC (4,18 мм², p = 0,054) по сравнению с контрольной группой. При использовании повязки с оксизолем Ag наблюдалось усиление регенерации эпителия по сравнению с контрольной группой (30% против 22% соответственно), хотя это различие не достигло статистической значимости (p = 0,067), но оно достаточно значимо и подтверждает предыдущие результаты. Повязка с оксизолем способствует реэпителизации. - Эпителизация неинфицированных ран17. В отличие от этого, лечение повязками Ag1+ или Ag1+ + EDTA/BC не оказало никакого эффекта или показало снижение реэпителизации по сравнению с контролем.
Влияние серебряной повязки на заживление ран у неинфицированных мышей с полной резекцией. (AD) Репрезентативные макроскопические изображения ран после трех дней лечения неантимикробной контрольной повязкой и серебряной повязкой. (EH) Репрезентативные срезы ран, окрашенные гематоксилином и эозином. Количественная оценка площади раны (I) и процента реэпителизации (J) рассчитывались по гистологическим срезам в середине раны с использованием программного обеспечения для анализа изображений (n = 11–12 на каждую группу лечения). Графики показывают среднее значение +/- стандартную ошибку. * означает p = <0,05.
Серебро имеет долгую историю применения в качестве антимикробной терапии при заживлении ран, однако множество различных составов и методов доставки может приводить к различиям в антимикробной эффективности¹⁸. Более того, антибиопленочные свойства конкретных систем доставки серебра до конца не изучены. Хотя иммунный ответ организма относительно эффективен против планктонных бактерий, он, как правило, менее эффективен против биопленок¹⁹. Планктонные бактерии легко фагоцитируются макрофагами, но внутри биопленок агрегированные клетки создают дополнительные проблемы, ограничивая ответ организма до такой степени, что иммунные клетки могут подвергаться апоптозу и высвобождать провоспалительные факторы для усиления иммунного ответа²⁰. Было замечено, что некоторые лейкоциты могут проникать в биопленки²¹, но не способны фагоцитировать бактерии, как только эта защита ослаблена²². Для поддержки иммунного ответа организма против инфекции раневой биопленки следует использовать целостный подход. Хирургическая обработка раны может физически разрушить биопленку и удалить большую часть микробной нагрузки, но иммунный ответ организма может быть неэффективным против оставшейся биопленки, особенно если он ослаблен. Таким образом, антимикробная терапия, такая как серебряные повязки, может поддерживать иммунный ответ организма и устранять биопленочные инфекции. Состав, концентрация, растворимость и субстрат доставки могут влиять на антимикробную эффективность серебра. В последние годы достижения в технологии обработки серебра сделали эти повязки более эффективными9,23. По мере развития технологии серебряных повязок важно понимать эффективность этих повязок в борьбе с инфекцией ран и, что более важно, влияние этих сильнодействующих форм серебра на среду раны и заживление.
В данном исследовании мы сравнили эффективность двух современных серебряных повязок с обычными серебряными повязками, продуцирующими ионы Ag1+, против биопленок, используя различные модели in vitro и in vivo. Мы также оценили влияние этих повязок на состояние раны и заживление, не зависящее от инфекции. Для минимизации влияния матрицы доставки все протестированные серебряные повязки были изготовлены из карбоксиметилцеллюлозы.
Наша предварительная оценка эффективности этих серебряных повязок против колониальных биопленок Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus показывает, что, в отличие от традиционных повязок с Ag1+, две усовершенствованные серебряные повязки, Ag1+ + EDTA/BC и оксигенированные соли серебра, эффективны в 5 раз. Они эффективно уничтожают бактерии биопленки в течение нескольких дней. Кроме того, эти повязки предотвращают повторное образование биопленки при повторном воздействии планктонных бактерий. Повязка Ag1+ содержала хлорид серебра, то же самое соединение серебра и базовую матрицу, что и Ag1+ + EDTA/BC, и оказывала ограниченное влияние на жизнеспособность бактерий в биопленке в течение того же периода. Наблюдение, что повязка Ag1+ + EDTA/BC была более эффективна против биопленки, чем повязка Ag1+, состоящая из той же матрицы и соединения серебра, подтверждает предположение о необходимости дополнительных ингредиентов для повышения эффективности хлорида серебра против биопленки, как сообщалось ранее15. Эти результаты подтверждают идею о том, что БЦ и ЭДТА играют дополнительную роль, способствуя общей эффективности повязки, и что отсутствие этого компонента в повязках с Ag1+ могло способствовать отсутствию демонстрации эффективности in vitro. Мы обнаружили, что повязки с оксигенированными солями серебра, продуцирующие ионы Ag2+ и Ag3+, демонстрировали более сильную антибактериальную эффективность, чем Ag1+, и на уровнях, аналогичных Ag1+ + ЭДТА/БЦ. Однако из-за высокого окислительно-восстановительного потенциала неясно, как долго ионы Ag3+ остаются активными и эффективными против раневых биопленок, и поэтому требуют дальнейшего изучения. Кроме того, существует множество различных повязок, генерирующих ионы Ag1+, которые не были протестированы в этом исследовании. Эти повязки состоят из различных соединений серебра, имеют разные концентрации и базовые матрицы, что может влиять на доставку ионов Ag1+ и их эффективность против биопленок. Также стоит отметить, что существует множество различных моделей in vitro и in vivo, используемых для оценки эффективности раневых повязок против биопленок. Тип используемой модели, а также содержание соли и белка в средах, применяемых в этих моделях, влияют на эффективность повязки. В нашей модели in vivo мы позволили биопленке созреть in vitro, а затем перенесли ее на дермальную поверхность раны. Иммунный ответ мышей-хозяев относительно эффективен против планктонных бактерий, нанесенных на рану, в результате чего по мере заживления раны образуется биопленка. Добавление зрелой биопленки к ране ограничивает эффективность иммунного ответа хозяина на образование биопленки, позволяя зрелой биопленке закрепиться в ране до начала заживления. Таким образом, наша модель позволяет нам оценить эффективность антимикробных повязок на зрелых биопленках до начала заживления ран.
Мы также обнаружили, что плотное прилегание повязки влияло на эффективность серебряных повязок на биопленках, выращенных in vitro, и на свиной коже. Тесный контакт с раной считается критически важным для антимикробной эффективности повязки24,25. Повязки, содержащие оксигенированные соли серебра, находились в тесном контакте со зрелыми биопленками, что приводило к значительному снижению количества жизнеспособных бактерий в биопленке через 24 часа. В отличие от этого, при обработке повязками Ag1+ и Ag1+ + EDTA/BC значительное количество жизнеспособных бактерий оставалось. Эти повязки содержат швы по всей длине, что создает мертвые пространства, препятствующие тесному контакту с биопленкой. В наших исследованиях in vitro эти бесконтактные участки препятствовали уничтожению жизнеспособных бактерий в биопленке. Мы оценивали жизнеспособность бактерий только через 24 часа после обработки; со временем, по мере насыщения повязки, мертвых пространств может становиться меньше, уменьшая площадь для этих жизнеспособных бактерий. Однако это подчеркивает важность состава повязки, а не только типа серебра в ней.
Хотя исследования in vitro полезны для сравнения эффективности различных технологий с использованием серебра, важно также понимать воздействие этих повязок на биопленки in vivo, где тканевые и иммунные реакции организма-хозяина влияют на эффективность повязок против биопленок. Влияние этих повязок на раневые биопленки изучалось с помощью сканирующей электронной микроскопии и окрашивания биопленки внеклеточными полимерными веществами (ВПВ) с использованием внутриклеточных и внеклеточных красителей ДНК. Мы обнаружили, что после 3 дней лечения все повязки были эффективны в снижении количества внеклеточной ДНК в ранах, инфицированных биопленками, но повязка Ag1+ была менее эффективна в ранах, инфицированных Staphylococcus aureus. Сканирующая электронная микроскопия также показала, что в ранах, обработанных серебряными повязками, присутствовало значительно меньше бактерий, хотя это было более выражено при использовании повязки с оксигенированной солью серебра и повязки Ag1+ + EDTA/BC по сравнению с повязкой Ag1+. Эти данные показывают, что протестированные серебряные повязки оказывали различное воздействие на структуру биопленки, но ни одна из них не смогла полностью уничтожить биопленку, что подтверждает необходимость целостного подхода к лечению инфекций, вызванных раневой биопленкой; в частности, использования серебряных повязок. Лечение предшествует физической обработке раны для удаления большей части биопленки.
Хронические раны часто находятся в состоянии сильного воспаления, при этом избыток воспалительных клеток остается в раневой ткани в течение длительного времени, вызывая повреждение тканей и истощая запасы кислорода, необходимого для эффективного клеточного метаболизма и функционирования раны26. Биопленки усугубляют эту неблагоприятную среду в ране, негативно влияя на заживление различными способами, включая ингибирование пролиферации и миграции клеток и активацию провоспалительных цитокинов27. По мере повышения эффективности серебряных повязок важно понимать их влияние на среду раны и процесс заживления.
Интересно, что, хотя все серебряные повязки влияли на состав биопленки, только повязки с оксигенированными солями серебра усиливали реэпителизацию этих инфицированных ран. Эти данные подтверждают наши предыдущие результаты17 и результаты Калана и др. (2017)28, которые продемонстрировали хорошие профили безопасности и токсичности оксигенированных солей серебра, поскольку более низкие концентрации серебра были эффективны против биопленок.
Наше текущее исследование подчеркивает различия в серебряной технологии между антимикробными серебряными повязками и влияние этой технологии на среду раны и заживление, не зависящее от инфекции. Однако эти результаты отличаются от предыдущих исследований, показавших, что повязка Ag1+ + EDTA/BC улучшает параметры заживления поврежденных ушей кроликов in vivo. Тем не менее, это может быть связано с различиями в моделях животных, времени измерения и методах нанесения бактерий29. В данном случае измерения раны проводились через 12 дней после травмы, чтобы активные ингредиенты повязки могли воздействовать на биопленку в течение более длительного периода времени. Это подтверждается исследованием, показавшим, что клинически инфицированные язвы на ногах, леченные Ag1+ + EDTA/BC, первоначально увеличивались в размере через одну неделю лечения, а затем в течение следующих 3 недель лечения Ag1+ + EDTA/BC и в течение 4 недель использования неантимикробных препаратов. Повязки CMC уменьшают размер язв30.
Ранее было показано, что определенные формы и концентрации серебра обладают цитотоксическим действием in vitro¹¹, однако эти результаты in vitro не всегда приводят к неблагоприятным последствиям in vivo. Кроме того, достижения в области серебряных технологий и лучшее понимание соединений серебра и их концентраций в перевязочных материалах привели к разработке множества безопасных и эффективных серебряных повязок. Однако по мере развития серебряных повязок важно понимать их влияние на раневую среду³¹,³²,³³. Ранее сообщалось, что увеличение скорости реэпителизации соответствует увеличению доли противовоспалительных макрофагов M2 по сравнению с провоспалительным фенотипом M1. Это было отмечено в предыдущей модели на мышах, где сравнивались серебряные гидрогелевые повязки с сульфадиазином серебра и неантимикробными гидрогелями³⁴.
Хронические раны могут характеризоваться чрезмерным воспалением, и было замечено, что избыток нейтрофилов может негативно влиять на заживление ран35. В исследовании на мышах с дефицитом нейтрофилов присутствие нейтрофилов замедляло реэпителизацию. Избыток нейтрофилов приводит к высоким уровням протеаз и активных форм кислорода, таких как супероксид и перекись водорода, которые связаны с хроническими и медленно заживающими ранами37,38. Аналогично, увеличение количества макрофагов, если оно не контролируется, может привести к замедлению заживления ран39. Это увеличение особенно важно, если макрофаги не способны перейти от провоспалительного фенотипа к фенотипу, способствующему заживлению, в результате чего раны не выходят из воспалительной фазы заживления40. Мы наблюдали снижение количества нейтрофилов и макрофагов в ранах, инфицированных биопленкой, после 3 дней лечения всеми серебряными повязками, но снижение было более выраженным при использовании оксигенированных солевых повязок. Это снижение может быть прямым результатом иммунного ответа на серебро, реакции на снижение микробной нагрузки или нахождения раны на более поздней стадии заживления, что приводит к уменьшению количества иммунных клеток в ране. Снижение количества воспалительных клеток в ране может поддерживать среду, благоприятную для заживления раны. Механизм действия оксисолей серебра, способствующих заживлению, не зависящему от инфекции, неясен, но способность оксисолей серебра производить кислород и разрушать вредные уровни перекиси водорода, медиатора воспаления, может объяснить это и требует дальнейшего изучения17.
Хронические незаживающие инфицированные раны представляют проблему как для врачей, так и для пациентов. Хотя многие перевязочные материалы заявляют о своей антимикробной эффективности, исследования редко фокусируются на других ключевых факторах, влияющих на микроокружение раны. Данное исследование показывает, что различные технологии с использованием серебра обладают разной антимикробной эффективностью и, что важно, разным воздействием на микроокружение раны и заживление, независимо от наличия инфекции. Хотя эти исследования in vitro и in vivo демонстрируют эффективность этих перевязочных материалов в лечении раневых инфекций и ускорении заживления, необходимы рандомизированные контролируемые исследования для оценки эффективности этих перевязочных материалов в клинической практике.
Использованные и/или проанализированные в ходе данного исследования наборы данных доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу.
Дата публикации: 15 июля 2024 г.