Спасибо за посещение Nature.com. Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS. Для достижения наилучших результатов мы рекомендуем использовать более новую версию вашего браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В то же время, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы отображаем сайт без стиля или JavaScript.
Рост микробов в ранах часто проявляется как биопленки, которые мешают заживлению и трудно искоренить. Новые серебряные повязки утверждают, что борьба с раневыми инфекциями, но их антибиофильмская эффективность и независимые от инфекции эффекты заживления, как правило, неизвестны. Используя модели биопленки in vitro и in vivo Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, мы сообщаем о эффективности ионных повязок AG1+; Ag1+ завязки, содержащие этилендиаминтетраксусную кислоту и хлорид бензетония (Ag1+/EDTA/BC), и повязки, содержащие нитрат серебра (Ag Oxysalts). , которые производят ионы Ag1+, Ag2+ и Ag3+ для борьбы с биопленкой раны и его влияния на заживление. Ag1+ повязки оказали минимальное влияние на биопленку раны in vitro и у мышей (C57BL/6J). Напротив, оксигенированные соли Ag и повязки Ag1+/EDTA/BC значительно снижали количество жизнеспособных бактерий в биопленках in vitro и продемонстрировали значительное снижение компонентов бактериальных и EPS в биопленках раны мыши. Эти повязки оказали различное влияние на заживление ранов, инфицированных биопленкой, и не инфицированных биофильмами, с оксигенированными солевыми повязок, оказывающими более выгодное влияние на реэпителизацию, размер раны и воспаление по сравнению с контрольными процедурами и другими повязками серебра. Различные физико-химические свойства серебряных повязки могут оказывать различное влияние на биопленку и заживление раны, и это следует учитывать при выборе повязки для лечения ранов, инфицированных биопленкой.
Хронические раны определяются как «раны, которые не проходят через нормальные стадии заживления упорядоченным и своевременным образом» 1. Хронические раны создают психологическое, социальное и экономическое бремя для пациентов и системы здравоохранения. Ежегодные расходы NHS на лечение ран и связанные сопутствующие заболевания оцениваются в 8,3 млрд. Фунтов стерлингов в 2017–182 годах. Хронические раны также являются насущной проблемой в Соединенных Штатах, причем Medicare оценивает годовую стоимость лечения пациентов с ранами в 28,1–96,8 млрд. Долл. США.
Инфекция является основным фактором, предотвращающим заживление ран. Инфекции часто проявляются в виде биопленки, которые присутствуют в 78% нежидящих хронических ран. Биопленки формируются, когда микроорганизмы становятся необратимо прикрепленными к поверхностям, таким как поверхности раны, и могут агрегировать с образованием внеклеточных сообществ, продуцирующих, продуцирующие сообщества. Биопленка раны связана с повышенным воспалительным ответом, приводящим к повреждению тканей, что может задержать или предотвратить заживление4. Увеличение повреждения тканей может быть частично обусловлено повышенной активностью матриксных металлопротеиназ, коллагеназы, эластазы и реактивных форм кислорода5. Кроме того, воспалительные клетки и биопленки сами являются высокими потребителями кислорода и, следовательно, могут вызывать локальную ткани гипоксию, истощая клетки жизненно важного кислорода, необходимые для эффективного восстановления тканей 6.
Зрелые биопленки очень устойчивы к антимикробным агентам, что требует агрессивных стратегий для контроля инфекций биопленки, таких как механическое лечение с последующей эффективной антимикробной обработкой. Поскольку биопленки могут быстро регенерировать, эффективные антимикробные препараты могут снизить риск повторной формации после хирургического борьбы7.
Серебро все чаще используется в антимикробных повязках и часто используется в качестве первой линии лечения хронических инфицированных ран. Существует много коммерчески доступных серебряных повязок, каждая из которых содержит различную серебряную композицию, концентрацию и базовую матрицу. Достижения в серебряных повязках привели к разработке новых серебряных повязков. Металлическая форма серебра (Ag0) инертная; Чтобы достичь антимикробной эффективности, он должен потерять электрон с образованием ионного серебра (AG1+). Традиционные серебряные заправки содержат серебряные соединения или металлическое серебро, которые при воздействии жидкости разлагаются с образованием ионов Ag1+. Эти ионы AG1+ реагируют с бактериальной клеткой, удаляя электроны из структурных компонентов или критических процессов, необходимых для выживания. Запатентованная технология привела к разработке нового серебряного соединения, Ag Oxysalts (нитрат серебра, Ag7no11), который включен в заправки для раны. В отличие от традиционного серебра, разложение соли, содержащих кислород, производит состояния серебра с более высокой валентностью (Ag1+, Ag2+и Ag3+). Исследования in vitro показали, что низкие концентрации солей серебра кислорода более эффективны, чем одно ионное серебро (Ag1+) против патогенных бактерий, таких как Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Escherichia coli8,9. Другой новый тип серебряной заправки включает в себя дополнительные ингредиенты, а именно этилендиаминтетрассовую кислоту (ЭДТА) и хлорид бензетония (БК), которые, как сообщается, представляют собой биопленку целевой биопленки и тем самым увеличивают проникновение серебра в биопленку. Эти новые серебряные технологии предлагают новые способы нацеливания на биопленки раны. Тем не менее, влияние этих антимикробных препаратов на раневую среду и независимое от инфекции заживление важно для того, чтобы они не создавали неблагоприятную ранускую среду или задерживают заживление. Сообщалось о проблемах по поводу цитотоксичности серебра in vitro с несколькими серебряными повязками10,11. Тем не менее, цитотоксичность in vitro еще не переведена в токсичность in vivo, и несколько повязок AG1+ продемонстрировали хороший профиль безопасности12.
Здесь мы исследовали эффективность карбоксиметилцеллюлозных повязки, содержащих новые серебряные составы против биопленки раны in vitro и in vivo. Кроме того, было оценено влияние этих повязки на иммунные реакции и исцеление, независимо от инфекции.
Все используемые заправки были коммерчески доступны. 3M Kerracel Gel Fiber Pressing (3M, Knutsford, UK)-это неативонциробная 100% карбоксиметилцеллюлоза (CMC) гель-привязка, которая использовалась в качестве контрольной заправки в этом исследовании. Были оценены три антимикробные серебряные поправки CMC, а именно 3M Cerracel AG Preseding (3M, Knutsford, UK), которая содержит 1,7 мас.%. оксигенированная серебряная соль (AG7NO11) в ионах серебра с более высокой валентностью (AG1+, Ag2+и Ag3+). Во время разложения ионов AG7NO11, ионы Ag1+, Ag2+ и Ag3+ образуются в соотношении 1: 2: 4. Aquacel AG дополнительная заправка, содержащая 1,2% хлорида серебра (Ag1+) (Convatec, Deeside, UK) 13 и Acacel Ag+дополнительная заправка, содержащая 1,2% хлорид серебра (Ag1+), ЭДТА и бензетоний хлорид (Convatec, Deeside, UK) 14.
Штаммы, используемые в этом исследовании, были Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) и Staphylococcus aureus nctc 6571 (общественное здравоохранение, Англия, Солсбери).
Бактерии выращивали в течение ночи в бульоне Мюллера-Хинтона (Oxoid, Altrincham, UK). Культуру для ночной культуры затем разбавляли 1: 100 в бульоне Мюллера-Хинтона и 200 мкл высажены на стерильные 0,2 мкм мембраны циклопора Whatman (Whatman Plc, Мейдстон, Великобритания) на пластины с агаром Мюллера-Хинтона (Sigma-Aldrich Company Ltd, Кент, Великобритания, Великобритания. ) ) Колониальная биопленка при 37 ° С в течение 24 часов. Эти колониальные биопленки были протестированы на логарифмическую усадку.
Нарежьте заправку на 3 см2 квадратных кусочков и предварительно протянувшись стерильной деионизированной водой. Поместите повязку на биопленку колонии на агарской тарелке. Каждое 24 га биопленки удаляли, и жизнеспособные бактерии в биопленке (КОЕ/мл) определяли количественно последовательным разведением (от 10-1 до 10-7) в бульоне нейтрализации дневного угла (Merck-Millipore). Через 24 часа инкубации при 37 ° С на пластинах с агаром Мюллера-Хинтона проводилось стандартное количество пластин. Каждое время лечения и времени проводили в трех экземплярах, а количество пластин повторяли для каждого разбавления.
Кожа свиного живота получает у женщин больших белых свиней в течение 15 минут после убоя в соответствии со стандартами экспорта Европейского Союза. Кожу побрили и очищали салфетками, затем замораживали при -80 ° C в течение 24 часов, чтобы развивать кожу. После оттаивания кусочки кожи 1 см2 трижды промывали PBS, 0,6% гипохлорита натрия и 70% этанола в течение 20 минут каждый раз. Перед удалением эпидермиса удалите оставшийся этанол, промывая 3 раза в стерильном PBS. Кожа культивировали в 6-луночной пластине с нейлоновой мембраной толщиной 0,45 мкм (Merck-Millipore) сверху и 3 абсорбирующими прокладками (Merck-Millipore), содержащей 3 мл плода сыворотки (Sigma) с модифицированной Dulbecco. Орел. Средний (Модифицированный Eagle Medium's Dulbecco - Aldrich Ltd.).
Колониальные биопленки выращивали, как описано для исследований биопленки. После культивирования биопленки на мембране в течение 72 часов биопленка была нанесена на поверхность кожи с использованием стерильной петли инокуляции, и мембрану удаляли. Затем биопленку инкубировали на дерме свиньи в течение дополнительных 24 часов при 37 ° C, чтобы дать биопленку созревать и придерживаться кожи свиньи. После того, как биопленка созрела и прикреплена, повязка 1,5 см2, предварительно протянутая стерильной дистиллированной водой, наносилась непосредственно на поверхность кожи и инкубировала при 37 ° С в течение 24 часов. Жизнеспособные бактерии визуализировали путем окрашивания путем равномерного применения реагента жизнеспособности клеток Prestoblue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK) к апикальной поверхности каждого эксплантата и инкубации в течение 5 минут. Используйте цифровую камеру Leica DFC425, чтобы мгновенно снимать изображения на микроскопе Leica MZ8. Цветные розовые области были количественно определены с использованием программного обеспечения Image Pro версию 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (MediaCy.com)). Сканирующую электронную микроскопию проводили, как описано ниже.
Бактерии, выращенные в течение ночи, разбавляли 1: 100 в бульоне Мюллера-Хинтона. 200 мкл культуры добавляли в стерильную мембрану циклопора 0,2 мкм (Whatman, Maidstone, Великобритания) и выделили на агар Мюллера-Хинтона. Биоплентные пластины инкубировали при 37 ° С в течение 72 часов, чтобы обеспечить зрелую биопленку.
Через 3 дня созревания биопленки была размещена квадратная повязка 3 см2 непосредственно на биопленку и инкубировали при 37 ° С в течение 24 часов. После удаления повязки с поверхности биопленки 1 мл реагента жизнеспособности клеток Prestoblue (Invitrogen, Waltham, MA) добавляли к поверхности каждой биопленки в течение 20 секунд. Поверхности были высушены до того, как изменения цвета были записаны с использованием цифровой камеры Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Кингстон, Великобритания).
Подготовьте ночные культуры на агаре Мюллера-Хинтона, перенесите отдельные колонии в 10 мл бульона Мюллера-Хинтона и инкубируйте на шейкере при 37 ° C (100 об / мин). После ночной инкубации культуру разбавляли 1: 100 в бульоне Мюллера-Хинтона и 300 мкл были обнаружены на круговой мембране циклопора 0,2 мкм (Whatman International, Maidstone, UK) на агаре Мюллера-Хинтона и инкубировали при 37 ° C в течение 72 часов. Полем Полем Зрелая биопленка была применена к ране, как описано ниже.
Вся работа с животными проводилась в Университете Манчестера по лицензии проекта, утвержденной Управлением по защите животных и этическим обзором (P8721BD27) и в соответствии с руководящими принципами, опубликованными Министерством внутренних дел в соответствии с пересмотренной ASPA 2012 года. Все авторы придерживались руководящих принципов прибытия. Восьминедельные мыши C57BL/6J (Envigo, Oxon, UK) использовались для всех исследований in vivo. Мышей были анестезированы изофлураном (Piramal Critical Care Ltd, Западный Дрейтон, Великобритания), и их спинные поверхности были побриты и очищены. Каждому мышью дали удаленную рану 2 × 6 мм с использованием биопсионного удара Stiefel (Schuco International, Хартфордшир, Великобритания). Для биопленки, инфицированных ранами, нанесите 72-часовую колониальную биопленку, выращенную на мембране, как описано выше, на кожный слой раны с использованием стерильной петли инокуляции сразу после повреждения, и отбросьте мембрану. Один квадратный сантиметр повязки предварительно протянут стерильной водой для поддержания влажной раны. Повязки применялись непосредственно к каждой ране и покрыты 3 -метровой пленкой тегадерма (3M, Брэкнелл, Великобритания) и жидким клеем мастизола (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI), применяемые по краям, чтобы обеспечить дополнительную адгезию. Бупренорфин (Animalcare, Йорк, Великобритания) вводили в концентрации 0,1 мг/кг в качестве анальгетика. Отключите мышей через три дня после травмы, используя метод Списка 1 и удалите, вдвое и сохраните область раны по мере необходимости.
Гематоксилин (термофиширский научный) и окрашивание эозина (научное научно -термофишер) проводили в соответствии с протоколом производителя. Область раны и Reepithelization были количественно определены с использованием программного обеспечения Image Pro версию 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Срезы ткани деэгревались в ксилоле (Thermofisher Scientific, Loughborough, UK), регидратировали с 100–50% градуированным этанолом и кратко погружены в деионизированную воду (Thermofisher Scientific). Иммуногистохимия проводили с использованием набора Vectastain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) в соответствии с протоколом производителя. Первичные антитела к нейтрофилам NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) и макрофагам MS CD107B Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, UK) разбавляли 1: 100 в блокирующем растворе и добавляли в поверхность среза, с последующими 2 антителами против, Vectastain. ABC и Vector Nova Red Peroxidase (HRP) комплект субстрата (Vector Laboratories, Burlingame, CA) и окрашены гематоксилином. Изображения были получены с использованием микроскопа Olympus BX43 и цифровой камеры Olympus DP73 (Olympus, Southend-On-Sea, Великобритания).
Образцы кожи фиксировали в 2,5% глутаральдегиде и 4% формальдегид в 0,1 м HEPES (рН 7,4) в течение 24 часов при 4 ° C. Образцы дегидратировали с использованием градуированного этанола и сушили в CO2 с использованием критической сушилки K850 K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, UK) и Sputter, покрытой золотым сплавом с сплавом кворум SC7620 Mini Sputterer/Glow. Образцы были визуализированы с использованием сканирующего электронного микроскопа FEI Quanta 250 (Thermofisher Scientific) для визуализации центральной точки раны.
Йодид TOTO-1 (2 мкМ) применяли на иссеченную поверхность раны мыши и инкубировали в течение 5 минут при 37 ° C (Thermofisher Scientific) и обрабатывали Syto-60 (10 мкМ) при 37 ° C (Thermofisher Scientific). 15-минутные изображения Z-Stack были созданы с использованием Leica TCS SP8.
Биологические и технические повторные данные были таблица и проанализированы с использованием программного обеспечения GraphPad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Односторонний дисперсионный анализ с множественными сравнениями с использованием последующего теста Даннетта был использован для проверки различий между каждой обработкой и непреодолимым контролем. Значение p <0,05 считалось значимым.
Эффективность волокнистых повязок серебряного геля впервые оценивалась против биоплентных колоний Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa in vitro. Серебряные заправки содержат разные формулы серебра: традиционные серебряные заправки производят ионы Ag1+; Серебряные повязки, которые могут производить ионы Ag1+ после добавления EDTA/BC, могут разрушить матрицу биопленки и подвергать бактерии с серебром под антибактериальным эффектом серебра. Ионы15 и повязки, содержащие кислородные соли Ag, которые производят ионы Ag1+, Ag2+ и Ag3+. Его эффективность сравнивалась с неконтентифицированной контрольной заправкой, изготовленной из мужских волокон. Оставшиеся жизнеспособные бактерии в биопленке оценивали каждые 24 часа в течение 8 дней (рис. 1). На 5 -й день биопленка была повторна с помощью 3,85 × 105 с. Staphylococcus aureus или 1,22 × 105p. Aeruginosa для оценки восстановления биопленки. По сравнению с непреодолимыми контрольными повязками, поправки AG1+ оказали минимальное влияние на жизнеспособность бактерий у Staphylococcus aureus и Pseudomonas Aeruginosa BioFilms в течение 5 дней. Напротив, повязки, содержащие кислородочные соли Ag и Ag1 + + EDTA/BC, были эффективны в убийстве бактерий в пределах биопленки в течение 5 дней. После повторной инокуляции планктонными бактериями в 5 -й день восстановление биопленки не наблюдалось (рис. 1).
Количественная оценка жизнеспособных бактерий у Staphylococcus aureus и биопленки Pseudomonas aeruginosa после обработки серебряными повязками. Биопленки колонии Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa обрабатывали серебряными повязок или неконтемикробными контрольными заправками, а количество оставшихся жизнеспособных бактерий определяли каждые 24 часа. Через 5 дней биопленка была повторно с помощью 3,85 × 105 с. Staphylococcus aureus или 1,22 × 105p. Колонии бактериопланктона Pseudomonas aeruginosa образовали индивидуально для оценки восстановления биопленки. Графики показывают среднее значение +/- стандартная ошибка.
Чтобы визуализировать влияние серебряных повязок на биопленку, поправки были нанесены на зрелые биопленки, выращенные на коже свиной, ex vivo. Через 24 часа заправка удаляется, а биопленка окрашивается синим реактивным красителем, который метаболизируется живыми бактериями до розового цвета. Биопленки, обработанные контрольной заправками, были розовыми, что указывает на наличие жизнеспособных бактерий в биопленке (рис. 2а). Напротив, биопленка, обработанная оксисольской заправкой Ag, была в основном синей, что указывает на то, что оставшиеся бактерии на поверхности кожи свиньи были нежизнеспособными бактериями (рис. 2B). Смешанная синяя и розовая окраска наблюдалась в биопленках, обработанных Ag1+ -содержащими заправками, что указывает на наличие жизнеспособных и нежизнеспособных бактерий в биопленке (рис. 2C), тогда как поправки EDTA/BC, содержащие AG1+, были преимущественно синими с некоторыми розовыми пятнами. Указание участков, не затронутых серебряной заправкой (Рисунок 2D). Количественная оценка активных (розовых) и неактивных (синих) областей показала, что контрольный пластырь составлял 75% активного (рис. 2e). Звязанность AG1 + + EDTA/BC выполнялась аналогично кислородному солевым повязкам Ag, с показателями выживаемости 13% и 14% соответственно. Перевалка AG1+ также снизила жизнеспособность бактерий на 21%. Эти биопленки затем наблюдались с использованием сканирующей электронной микроскопии (SEM). После лечения контрольной заправкой и заправкой AG1+ был обнаружен слой Pseudomonas aeruginosa, покрывающий кожу свиньи (рис. 2F, H), тогда как после обработки с помощью AG1+ заправо Коллагеновые волокна можно рассматривать как тканевая структура кожи свиней (рис. 2G). После обработки с помощью поправки AG1 + + EDTA/BC, были видны бактериальные бляшки и базовые бляшки коллагенового волокна (рис. 2I).
Визуализация биопленки Pseudomonas aeruginosa после серебряной заправки. (A-D) Бактериальная жизнеспособность в биопленках Pseudomonas aeruginosa, выращенных на коже свиньи, визуализировали с использованием красителя жизнеспособности Prestoblue 24 часа после обработки серебряными повязками или непреодолимыми поправками. Живые бактерии-это розовые, нежизные бактерии, а кожа свиньи синяя. (E) Количественная оценка биопленок Pseudomonas aeruginosa, выращенных на коже свиньи (розовое пятно) с использованием сканирующей электронной микроскопии Image Pro Version 10 (FI) и обработанной серебряной заправкой или неактивно-контрольной одеждой в течение 24 часов. SEM Scale Bar = 5 мкм. (J - M) Колониальные биопленки выросли на фильтрах и окрашивали реактивным красителем Prestoblue через 24 часа инкубации с серебряными повязками.
Чтобы определить, влияет ли близкий контакт между повязками и биопленками на эффективность повязки, колониальные биопленки, расположенные на плоской поверхности, обработали повязками в течение 24 часов, а затем окрашены реактивными красителями. Необработанная биопленка была темно -розовой по цвету (рис. 2J). В отличие от биопленки, обработанных повязками, содержащими кислородные соли Ag (рис. 2K), биопленки, обработанные повязками, содержащими Ag1+ или Ag1+++ EDTA/BC, показали полосы розового окрашивания (рис. 2L, M). Эта розовая окраска указывает на наличие жизнеспособных бактерий и связана с площадью шва в заправке. Эти сшитые области создают мертвые пространства, которые позволяют выжить бактерии внутри биопленки.
Чтобы оценить эффективность серебряных повязки in vivo, иссеченные раны мышей, инфицированные зрелыми биопленками S. aureus и P. aeruginosa, обработали неантимикробными контрольными заправками или серебряными заправками. После 3 дней обработки макроскопический анализ изображений показал меньшие размеры раны при обработке оксигенированными солевыми поправками по сравнению с неконтимикробными контрольными поправками и другими серебряными заправками (рис. 3A-H). Чтобы подтвердить эти наблюдения, раны собирали площадь раны, а реэпителизацию определяли количественно на срезах тканей, окрашенных гематоксилином и эозином с использованием программного обеспечения Image Pro версию 10 (рис. 3I-L).
Влияние серебряных повязок на поверхность раны и повторная эпителизация ран, инфицированных биопленками. (A - H) Небольшие клетки, инфицированные биопленками Pseudomonas aeruginosa (A - D) и Staphylococcus aureus (E - H) после трехдневного лечения с помощью неантимикробной контрольной одежды, оксигенированной соли Ag, заправка Ag1+ и Ag1+, оксигенированной солью Ag, Ag1+ и ag1+. заправка. Репрезентативные макроскопические изображения. Раны мышей с заправкой AG1 + + EDTA/BC. (IL) Репрезентативная инфекция Pseudomonas aeruginosa, гистологические срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, используемые для количественной оценки площади раны и регенерации эпителия. Количественная оценка площади раны (M, O) и процентной реэпителизации (N, P) ранов, инфицированных Pseudomonas aeruginosa (M, N) и Staphylococcus aureus (O, P) BioFilms (для группы лечения n = 12). Графики показывают среднее значение +/- стандартная ошибка. * означает p = <0,05 ** означает p = <0,01; Макроскопическая шкала = 2,5 мм, гистологическая шкала = 500 мкм.
Количественная оценка площади раны в ранах, инфицированных биопленкой Pseudomonas aeruginosa (фиг. 3M), показали, что раны, обработанные оксисальтами Ag, имели средний размер раны 2,5 мм2, в то время как у непревзойденной контрольной заправки было среднее размер раны 3,1 мм2. истинный. достигнута статистической значимости (рис. 3M). P = 0,423). Раны, обработанные Ag1+ или Ag1++ EDTA/BC, не показали снижения площади раны (3,1 мм2 и 3,6 мм2 соответственно). Обработка с помощью оксигенированной солевой заправки Ag, способствующей повторной эпителизации в большей степени, чем непревзойденная контрольная заправка (34% и 15% соответственно; P = 0,029) и Ag1+ или Ag1++ EDTA/BC (10% и 11%) ( Рисунок 3N). Полем , соответственно).
Подобные тенденции в области раны и эпителиальной регенерации наблюдались при ранах, инфицированных биопленками S. aureus (рис. 3O). Повязки, содержащие соли с серебром на кислороде, снижали площадь раны (2,0 мм2) на 23% по сравнению с контрольной неатенмикробной заправкой (2,6 мм2), хотя это восстановление не было значительным (р = 0,304) (рис. 3O). Кроме того, площадь раны в группе лечения AG1+ была слегка уменьшена (2,4 мм2), в то время как рана, обработанная с помощью поправки AG1++ EDTA/BC, не уменьшила площадь раны (2,9 мм2). Соли кислорода Ag также способствуют повторной эпителизации ранов, инфицированных биопленкой S. aureus (31%) в большей степени, чем те, которые обрабатывали неконтро-контрольными повязок (12%, P = 0,003) (рис. 3P). Ag1+ Перевалка (16%, P = 0,903) и Ag+ 1+ EDTA/BC Звякающая среда (14%, P = 0,965) показали уровни эпителиальной регенерации, аналогичные контролю.
Чтобы визуализировать влияние серебряных повязки на матрицу биопленки, было выполнено окрашивание йодида Syto 60 Syto 60 (рис. 4). Тото 1 йодид-это клеточный краситель, который можно использовать для точной визуализации внеклеточных нуклеиновых кислот, которые в изобилии в EPS биопленки. SYTO 60 - это проницаемый краситель ячейки, используемый в качестве Contrestain16. Наблюдения за йодидом Toto 1 и Syto 60 в ранах, инокулированных биопленками Pseudomonas aeruginosa (рис. 4А-D) и Staphylococcus aureus (рис. 4I-L), показали, что после 3 дней обработки обработки EPS в биопленке значительно уменьшилось. Содержит кислородные соли AG и Ag1 + + EDTA/BC. Ag1+ повязок без дополнительных антибиофильмных компонентов значительно снижала бесклеточную ДНК в ранах, инокулированных Pseudomonas aeruginosa, но были менее эффективными в ранах, инокулированных Staphylococcus aureus.
In vivo визуализация биопленки раны после 3 дней лечения контрольной или серебряной поправки. Конфокальные изображения Pseudomonas aeruginosa (A - D) и Staphylococcus aureus (I - L), окрашенные Toto 1 (зеленый) для визуализации внеклеточных нуклеиновых кислот, компонент внеклеточных биоплентных полимеров. Чтобы окрасить внутриклеточные нуклеиновые кислоты, используйте Syto 60 (красный). кислоты. P. Сканирующая электронная микроскопия ран, инфицированных Pseudomonas aeruginosa (E - H) и Staphylococcus aureus (M - P), после 3 дней лечения контрольными и серебряными поправками. SEM Scale Bar = 5 мкм. Шкала конфокальной визуализации = 50 мкм.
Сканирующая электронная микроскопия показала, что мыши, инокулированные биопленками колоний Pseudomonas aeruginosa (рис. 4E-H) и Staphylococcus aureus (рис. 4M-P), имели значительно меньше бактерий в ранах после 3 дней обработки со всеми серебряными заправками.
Чтобы оценить влияние серебряных повязки на воспаление раны у мышей, инфицированных биопленкой, секции инфицированных биопленки раны, обработанные контрольными или серебряными повязок в течение 3 дней, были иммуногистохимически окрашены с использованием антител, специфичных для нейтрофилов и макрофагов. Количественное определение нейтрофилов и макрофагов внутри. Грануляционная ткань. Рисунок 5). Все серебряные заправки уменьшали количество нейтрофилов и макрофагов в ранах, инфицированных Pseudomonas aeruginosa, по сравнению с неконтро-контрольными заправками после трех дней лечения. Тем не менее, обработка оксигенированной серебряной солевой повязкой привела к большему снижению нейтрофилов (P = <0,0001) и макрофагам (P = <0,0001) по сравнению с другими протестированными серебряными заправками (Figure 5i, J). Хотя AG1++ EDTA/BC оказал большее влияние на биопленку раны, он в меньшей степени снижал уровни нейтрофилов и макрофагов, чем заправка AG1+. Умеренные раны, инфицированные биопленкой S. aureus, также наблюдались после повязки с Ag (p = <0,0001), Ag1+ (P = 0,0008) и Ag1 ++ Edta/Bc (P = 0,0043) оксисола по сравнению с контролем. Подобные тенденции наблюдаются для нейтропении. Повязка (рис. 5K). Тем не менее, только окисленная соляная заправка Ag показала значительное снижение количества макрофагов в грануляционной ткани по сравнению с контролем в ранах, инфицированных биопленками S. aureus (P = 0,0339) (рис. 5L).
Нейтрофилы и макрофаги определяли количественно в ранах, инфицированных биопленками Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus после 3 дней лечения неконтро-контролем или поправками серебра. Нейтрофилы (AD) и макрофаги (EH) определяли количественно в срезах тканей, окрашенных антителами, специфичными для нейтрофилов или макрофагов. Количественная оценка нейтрофилов (I и K) и макрофагов (J и L) в ранах, инфицированных Pseudomonas aeruginosa (I и J) и Staphylococcus aureus (K & L). N = 12 на группу. Графики показывают среднее значение +/- стандартную ошибку, значения значимости по сравнению с не-антенбактериальной управляющей одеждой, * означает p = <0,05, ** означает p = <0,01; *** означает p = <0,001; Указывает p = <0,0001).
Затем мы оценили влияние серебряных повязок на независимое от инфекции исцеление. Не инфицированные эксцизионные раны обрабатывали неконтро-контрольной заправкой или серебряной заправкой в течение 3 дней (рис. 6). Среди протестированных серебряных повязки только раны, обработанные оксигенированной солевой заправкой, оказались меньше на макроскопических изображениях, чем раны, обработанные контролем (рис. 6А-D). Количественная оценка площади раны с использованием гистологического анализа показала, что средняя площадь раны после обработки с помощью оксисольской оксисольской оксисол составила 2,35 мм2 по сравнению с 2,96 мм2 для ранов, обработанных контрольной группой, но эта разница не достигла статистической значимости (P = 0,488) (рис. И Напротив, после обработки Ag1+ (3,38 мм2, P = 0,757) или Ag1+++ EDTA/BC (4,38 мм2, р = 0,054) поправки по сравнению с контрольной группой по сравнению с контрольной группой по сравнению с контрольной группой по сравнению с контрольной группой по сравнению с контрольной группой по сравнению с контрольной группой по сравнению с контрольной группой по сравнению с контрольной группой по сравнению с контрольной группой по сравнению с контрольной группой по сравнению с контрольной группой по сравнению с контрольной группой по сравнению с контрольной группой по сравнению с контрольной группой, не наблюдалось снижение площади раны. Повышенная эпителиальная регенерация наблюдалась с помощью оксизольной повязки Ag по сравнению с контрольной группой (30% против 22% соответственно), хотя это не достигло значимости (P = 0,067), это довольно значительно и подтверждает предыдущие результаты. Зубить с оксисолами способствует повторной эпителизации. -Потелизация неинфицированных ранов17. Напротив, обработка с помощью Ag1+ или Ag1+++ EDTA/BC не имела эффекта или показала снижение эпителизации по сравнению с контролем.
Влияние серебряной заправки на рану на заживление ран у неинфицированных мышей с полной резекцией. (AD) Репрезентативные макроскопические изображения ран после трехдневного лечения с помощью неконтентифицированной контрольной заправки и серебряной заправки. (EH) Репрезентативные рану срезы, окрашенные гематоксилином и эозином. Количественная оценка площади раны (I) и процент реэпителизации (J) рассчитывали по гистологическим срешкам в средней точке раны с использованием программного обеспечения для анализа изображений (n = 11–12 на группу лечения). Графики показывают среднее значение +/- стандартная ошибка. * означает p = <0,05.
Серебро имеет долгую историю использования в качестве антимикробной терапии при заживлении ран, но множество различных составов и методов доставки могут привести к различиям в противомикробной эффективности 18. Кроме того, антибиофильмные свойства конкретных систем доставки серебра не до конца понятны. Хотя иммунный ответ хозяина относительно эффективен против планктонных бактерий, он, как правило, менее эффективен против биопленки19. Планктонные бактерии легко фагоцитозируются макрофагами, но внутри биопленки агрегированные клетки создают дополнительные проблемы, ограничивая реакцию хозяина в той степени, в которой иммунные клетки могут подвергаться апоптозу и высвобождать провоспалительные факторы для усиления иммунного ответа20. Было отмечено, что некоторые лейкоциты могут проникнуть в биопленки21, но не могут иметь фагоцитозные бактерии, как только эта защита будет скомпрометирована22. Целостный подход должен использоваться для поддержки иммунного ответа хозяина против инфекции биопленки раны. Обеспокат раны может физически нарушать биопленку и удалять большую часть биобурдена, но иммунный ответ хозяина может быть неэффективным в отношении оставшейся биопленки, особенно если иммунный ответ хозяина поставлен под угрозу. Таким образом, антимикробные терапии, такая как серебряные повязки, могут поддерживать иммунный ответ хозяина и устранить инфекции биопленки. Состав, концентрация, растворимость и подложка доставки могут влиять на антимикробную эффективность серебра. В последние годы достижения в области технологии обработки серебра сделали эти повязки более эффективными9,23. По мере продвижения технологии серебряной заправки важно понимать эффективность этих повязки в борьбе с раневой инфекцией и, что более важно, влияние этих мощных форм серебра на рану и заживление.
В этом исследовании мы сравнили эффективность двух передовых серебряных повязок с обычными серебряными повязками, которые производят ионы AG1+ против биопленки с использованием различных моделей in vitro и in vivo. Мы также оценили влияние этих повязки на раневую среду и независимое от инфекции заживление. Чтобы свести к минимуму влияние матрицы доставки, все протестированные серебряные заправки состояли из карбоксиметилцеллюлозы.
Наша предварительная оценка этих серебряных повязок против колониальных биопленок Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus показывает, что, в отличие от традиционных повязок Ag1+, две продвинутые серебряные поправки, Ag1++ Edta/BC и кислородные соли Ag, эффективны в 5. несколько дней. Кроме того, эти повязки предотвращают повторную обработку биопленки при повторном воздействии планктонных бактерий. В заправке AG1+ содержалась хлорид серебра, ту же серебряную соединение и базовую матрицу, что и AG1++ EDTA/BC, и оказывала ограниченное влияние на жизнеспособность бактерий в биопленке за тот же период. Наблюдение о том, что поправка на биопленку AG1++ EDTA/BC была более эффективной против биопленки, чем заправка AG1+, состоящая из той же матрицы, и серебряное соединение подтверждает представление о том, что для повышения эффективности хлорида серебра в отношении биопленки необходимы дополнительные ингредиенты. в другом месте15. Эти результаты подтверждают идею о том, что BC и EDTA играют дополнительную роль, способствующую общей эффективности одежды, и что отсутствие этого компонента в повязках AG1+, возможно, способствовало продемонстрированию эффективности in vitro. Мы обнаружили, что оксигенированные солевые поправки Ag, производящие ионы Ag2+ и Ag3+, демонстрируют более высокую антибактериальную эффективность, чем Ag1+ и на уровнях, аналогичных Ag1++ EDTA/BC. Однако из -за высокого окислительно -восстановительного потенциала неясно, как долго ионы AG3+ остаются активными и эффективными в отношении биопленок раны, и, следовательно, заслуживают дальнейшего изучения. Кроме того, существует много разных повязок, которые генерируют ионы Ag1+, которые не были проверены в этом исследовании. Эти повязки состоят из различных серебряных соединений, концентраций и базовых матриц, которые могут влиять на доставку ионов AG1+ и их эффективность в отношении биопленки. Стоит также отметить, что существует много разных моделей in vitro и in vivo, используемых для оценки эффективности заправок раны в отношении биопленки. Тип используемой модели, а также содержание соли и белка в среде, используемых в этих моделях, будет влиять на эффективность заправки. В нашей модели in vivo мы позволили биопленке созревать in vitro, а затем перенести ее на кожуную поверхность раны. Иммунный ответ мышей -хозяина относительно эффективен против планктонных бактерий, применяемых к ране, тем самым образуя биопленку по мере заживления ран. Добавление зрелой биопленки к ране ограничивает эффективность иммунного ответа хозяина на образование биопленки, позволяя зрелой биопленке установить себя в ране до начала заживления. Таким образом, наша модель позволяет нам оценить эффективность антимикробных повязок на зрелых биопленках, прежде чем раны начнут заживлять.
Мы также обнаружили, что подгонка одевания повлияла на эффективность серебряных повязки на биопленках, выращенных in vitro и кожи свиньи. Тесный контакт с раной считается критическим для антимикробной эффективности заправки 24,25. Повязки, содержащие кислородные соли Ag, находились в тесном контакте со зрелыми биопленками, что привело к значительному снижению количества жизнеспособных бактерий в биопленке через 24 часа. Напротив, при обработке завязки AG1+ и Ag1+++ EDTA/BC осталось значительное количество жизнеспособных бактерий. Эти повязки содержат швы по всей длине заправки, которая создает мертвые пространства, которые предотвращают тесный контакт с биопленкой. В наших исследованиях in vitro эти неконтактные области предотвращали убийство жизнеспособных бактерий в биопленке. Мы оценили жизнеспособность бактерий только после 24 часов лечения; Со временем, поскольку повязка становится более насыщенной, может быть меньше мертвого пространства, уменьшая область для этих жизнеспособных бактерий. Тем не менее, это подчеркивает важность композиции заправки, а не только тип серебра в заправке.
Хотя исследования in vitro полезны для сравнения эффективности различных технологий серебра, также важно понимать влияние этих повязки на биопленки in vivo, где ткани хозяина и иммунные реакции способствуют эффективности повязки против биопленки. Влияние этих повязок на биопленки раны наблюдалось с использованием сканирующей электронной микроскопии и окрашивания EPS биопленки с использованием внутриклеточных и внеклеточных ДНК -красителей. Мы обнаружили, что после 3 дней лечения все повязки были эффективными в снижении бесклеточной ДНК в ранах, инфицированных биопленкой, но повязка AG1+ была менее эффективной у ран, инфицированных Staphylococcus aureus. Сканирующая электронная микроскопия также показала, что значительно меньше бактерий присутствовало в ранах, обработанных серебряными заправками, хотя это было более выражено с кислородной солевой заправкой Ag и заправкой Ag1++ EDTA/BC по сравнению с заправкой AG1+. Эти данные показывают, что протестированные серебряные повязки имели различные степени воздействия на структуру биопленки, но ни одна из серебряных повязок не мог искоренить биопленку, что подтверждает необходимость целостного подхода к лечению инфекций биопленки раны; Использование серебряных повязков. Лечению предшествует физическая обработка для удаления большей части биопленки.
Хронические раны часто находятся в состоянии тяжелого воспаления, причем избыточные воспалительные клетки остаются в раневой ткани в течение длительного периода времени, вызывая повреждение ткани и истощают кислород, необходимый для эффективного клеточного метаболизма и функционирования в ране26. Биопленки усугубляют эту враждебную раненную среду, отрицательно влияя на заживление различными способами, включая ингибирование пролиферации и миграции клеток и активацию провоспалительных цитокинов27. По мере того, как серебряные заправки становятся более эффективными, важно понять, какое влияние они оказывают на окружающую среду и исцеление.
Интересно, что, хотя все серебряные повязки влияли на состав биопленки, только окисленные соли для кислорода увеличивали повторную эпителизацию этих инфицированных ран. Эти данные подтверждают наши предыдущие результаты17 и данные Kalan et al. (2017) 28, которые продемонстрировали хорошую профили безопасности и токсичности солей с серебром кислорода, поскольку более низкие концентрации серебра были эффективны против биопленки.
Наше нынешнее исследование подчеркивает различия в технологии серебра между антимикробными серебряными повязок и влиянием этой технологии на среду раны и независимое от инфекции заживление. Тем не менее, эти результаты отличаются от предыдущих исследований, показывающих, что Ag1 + + + EDTA/BC, улучшает параметры заживления поврежденных ушей кролика in vivo. Однако это может быть связано с различиями в моделях животных, времени измерения и методах бактериального применения29. В этом случае измерения раны проводились через 12 дней после травмы, чтобы дать активные ингредиенты повязки действовать на биопленку в течение более длительного периода времени. Это подтверждается исследованием, которое показало, что клинически инфицированные язвы ноги, получавшие AG1 + + EDTA/BC, первоначально увеличились в размере после одной недели лечения, а затем в течение следующих 3 недель лечения AG1 + + EDTA/BC и в течение 4 недель после Использование не антимикробных препаратов. наркотики. CMC повязка, чтобы уменьшить размер язв 30.
Ранее было показано, что определенные формы и концентрации серебра являются цитотоксичными in vitro 11, но эти результаты in vitro не всегда приводят к побочным эффектам in vivo. Кроме того, достижения в области серебряных технологий и лучшее понимание серебряных соединений и концентраций в повязках привели к разработке многих безопасных и эффективных серебряных повязок. Тем не менее, по мере продвижения технологии серебряной заправки, важно понять влияние этих повязки на рану среды31,32,33. Ранее сообщалось, что повышенная скорость реэпителизации соответствует увеличению доли противовоспалительных макрофагов M2 по сравнению с провоспалительным фенотипом M1. Это было отмечено в предыдущей модели мыши, где серебряные гидрогелевые повязки сравнивались с сульфадиазином серебра и незимикробными гидрогелями34.
Хронические раны могут проявлять чрезмерное воспаление, и было отмечено, что наличие избыточных нейтрофилов может быть вредным для заживления ран. В исследовании у мышей, истощенных нейтрофилов, присутствие нейтрофилов задержало реэпителизацию. Присутствие избыточных нейтрофилов приводит к высоким уровням протеаз и активных форм кислорода, таких как супероксид и перекись водорода, которые связаны с хроническими и медленными ранами 37,38. Аналогичным образом, увеличение числа макрофагов, если неконтролируется, может привести к задержке заживления ран. Это увеличение особенно важно, если макрофаги не могут перейти от провоспалительного фенотипа к фенотипу про-заживания, что приводит к тому, что раны не смогли выйти на воспалительную фазу заживления40. Мы наблюдали снижение нейтрофилов и макрофагов в ранах, инфицированных биопленкой, после 3 дней лечения всеми серебряными заправками, но уменьшение было более выражено с оксигеносными солевыми поправками. Это снижение может быть прямым результатом иммунного ответа на серебро, ответ на снижение биобурдства или рану, находящейся в более поздней стадии заживления и, следовательно, иммунных клеток в ране уменьшается. Снижение количества воспалительных клеток в ране может поддерживать среду, способствующую заживлению ран. Механизм действия того, как Ag Oxysalts способствует независимому инфекции заживление, неясен, но способность Ag Oxysalts производить кислород и разрушать вредные уровни перекиси водорода, медиатор воспаления, может объяснить это и требует дальнейшего изучения17.
Хронические инфицированные раны, не связанные с зажиганием, представляют проблему как для врачей, так и для пациентов. Хотя многие повязки требуют антимикробной эффективности, исследования редко фокусируются на других ключевых факторах, влияющих на микроокружение раны. Это исследование показывает, что различные серебряные технологии обладают различной антимикробной эффективностью и, что важно, различные эффекты на раневую среду и заживление, независимо от инфекции. Хотя эти исследования in vitro и in vivo показывают эффективность этих повязок при лечении раневых инфекций и способности заживления, необходимы рандомизированные контролируемые исследования для оценки эффективности этих повязки в клинике.
Наборы данных, используемые и/или проанализированные во время текущего исследования, доступны от соответствующего автора по разумному запросу.
Время сообщения: 15-2024 июля