Гетерогенность волокон скелетных мышц человека, выходящая за рамки тяжелой цепи миозина.

Спасибо за посещение сайта nature.com. В используемой вами версии браузера поддержка CSS ограничена. Для наилучшего результата мы рекомендуем использовать последнюю версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Кроме того, для обеспечения дальнейшей поддержки, на этом сайте не будет стилей и JavaScript.
Скелетная мышца — это гетерогенная ткань, состоящая преимущественно из миофибрилл, которые у человека обычно классифицируются на три типа: один «медленный» (тип 1) и два «быстрых» (типы 2A и 2X). Однако гетерогенность между традиционными типами миофибрилл и внутри них остается малоизученной. Мы применили транскриптомный и протеомный подходы к 1050 и 1038 отдельным миофибриллам из латеральной широкой мышцы бедра человека соответственно. Протеомное исследование включало мужчин, а транскриптомное — 10 мужчин и 2 женщины. В дополнение к изоформам тяжелой цепи миозина мы идентифицировали метаболические белки, рибосомальные белки и белки клеточных соединений как источники многомерной межмиофибриллярной изменчивости. Кроме того, несмотря на идентификацию кластеров медленных и быстрых волокон, наши данные свидетельствуют о том, что волокна типа 2X фенотипически неотличимы от других быстросокращающихся волокон. Кроме того, классификация на основе тяжелых цепей миозина недостаточна для описания фенотипа миофибрилл при немалиновых миопатиях. В целом, наши данные указывают на многомерную гетерогенность миофибрилл, причем источники вариации выходят за рамки изоформ тяжелых цепей миозина.
Клеточная гетерогенность является неотъемлемой особенностью всех биологических систем, позволяя клеткам специализироваться для удовлетворения различных потребностей тканей и клеток.¹ Традиционная точка зрения на гетерогенность волокон скелетных мышц заключалась в том, что двигательные нейроны определяют тип волокна внутри двигательной единицы, а тип волокна (т.е. тип 1, тип 2A и тип 2X у человека) определяется характеристиками изоформ тяжелой цепи миозина (MYH).² Первоначально это основывалось на их нестабильности по отношению к pH-АТФазе^3,4, а позже — на молекулярной экспрессии MYH.⁵ Однако с идентификацией и последующим признанием «смешанных» волокон, которые совместно экспрессируют несколько MYH в различных пропорциях, волокна скелетных мышц все чаще рассматриваются как континуум, а не как отдельные типы волокон.⁶ Несмотря на это, в данной области по-прежнему широко используется MYH в качестве основного классификатора для классификации миофибрилл, что, вероятно, обусловлено ограничениями и значительными искажениями ранних исследований на грызунах, профили экспрессии MYH и диапазон типов волокон которых отличаются от таковых в этих исследованиях. у человека.² Ситуация еще больше осложняется тем, что различные скелетные мышцы человека демонстрируют разнообразный набор типов волокон.⁷ Латеральная широкая мышца бедра — это смешанная мышца с промежуточным (и, следовательно, репрезентативным) профилем экспрессии MYH.⁷ Кроме того, простота отбора проб делает ее наиболее изученной мышцей у человека.
Таким образом, беспристрастное исследование разнообразия волокон скелетных мышц с использованием мощных «омиксных» инструментов имеет решающее значение, но также представляет собой сложную задачу, отчасти из-за многоядерной природы волокон скелетных мышц. Однако технологии транскриптомики8,9 и протеомики10 в последние годы претерпели революцию в чувствительности благодаря различным технологическим достижениям, позволяющим анализировать скелетные мышцы на уровне отдельных волокон. В результате был достигнут значительный прогресс в характеристике разнообразия отдельных волокон и их реакции на атрофические стимулы и старение11,12,13,14,15,16,17,18. Важно отметить, что эти технологические достижения имеют клиническое применение, позволяя более детально и точно характеризовать дисрегуляцию, связанную с заболеваниями. Например, патофизиология немалиновой миопатии, одного из наиболее распространенных наследственных заболеваний мышц (MIM 605355 и MIM 161800), сложна и запутанна.19,20 Поэтому более точная характеристика нарушений регуляции волокон скелетных мышц может привести к значительному прогрессу в нашем понимании этого заболевания.
Мы разработали методы транскриптомного и протеомного анализа отдельных скелетных мышечных волокон, вручную выделенных из образцов биопсии человека, и применили их к тысячам волокон, что позволило нам исследовать клеточную гетерогенность скелетных мышечных волокон человека. В ходе этой работы мы продемонстрировали возможности транскриптомного и протеомного фенотипирования мышечных волокон и выявили метаболические, рибосомные и клеточные соединительные белки как значимые источники межволоконной изменчивости. Кроме того, используя этот протеомный подход, мы охарактеризовали клиническую значимость нематодной миопатии в отдельных скелетных мышечных волокнах, выявив скоординированный сдвиг в сторону неокислительных волокон независимо от типа волокна на основе MYH.
Для исследования гетерогенности волокон скелетных мышц человека мы разработали два рабочих процесса, позволяющих проводить транскриптомный и протеомный анализ отдельных волокон скелетных мышц (рисунок 1A и дополнительный рисунок 1A). Мы разработали и оптимизировали несколько методологических этапов, от хранения образцов и сохранения целостности РНК и белков до оптимизации пропускной способности для каждого подхода. Для транскриптомного анализа это было достигнуто путем введения специфических для образца молекулярных штрихкодов на начальном этапе обратной транскрипции, что позволило объединить 96 волокон для эффективной последующей обработки. Более глубокое секвенирование (±1 миллион прочтений на волокно) по сравнению с традиционными подходами к анализу отдельных клеток дополнительно обогатило данные транскриптома. 21 Для протеомики мы использовали короткий хроматографический градиент (21 минута) в сочетании с получением данных DIA-PASEF на масс-спектрометре timsTOF для оптимизации глубины протеомного анализа при сохранении высокой пропускной способности. 22,23 Для исследования гетерогенности здоровых скелетных мышечных волокон мы охарактеризовали транскриптомы 1050 отдельных волокон от 14 здоровых взрослых доноров и протеомы 1038 волокон от 5 здоровых взрослых доноров (дополнительная таблица 1). В данной статье эти наборы данных называются транскриптомами и протеомами 1000 волокон соответственно. Наш подход выявил в общей сложности 27 237 транскриптов и 2983 белка в транскриптомном и протеомном анализах 1000 волокон (рисунок 1A, дополнительные наборы данных 1–2). После фильтрации транскриптомных и протеомных наборов данных, содержащих более 1000 обнаруженных генов и 50% валидных значений на каждое волокно, был проведен последующий биоинформатический анализ для 925 и 974 волокон в транскриптоме и протеоме соответственно. После фильтрации в среднем было обнаружено 4257 ± 1557 генов и 2015 ± 234 белка (среднее ± стандартное отклонение) на каждое волокно, с ограниченной межиндивидуальной вариабельностью (дополнительные рисунки 1B–C, дополнительные наборы данных 3–4). Однако внутрисубъектная вариабельность была более выраженной среди участников, вероятно, из-за различий в выходе РНК/белка между волокнами разной длины и площади поперечного сечения. Для большинства белков (>2000) коэффициент вариации был ниже 20% (дополнительный рисунок 1D). Оба метода позволили получить широкий динамический диапазон транскриптов и белков с высокоэкспрессируемыми сигнатурами, важными для сокращения мышц (например, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (дополнительные рисунки 1E–F). Большинство выявленных признаков были общими для транскриптомных и протеомных наборов данных (дополнительный рисунок 1G), а средние интенсивности UMI/LFQ этих признаков были достаточно хорошо коррелированы (r = 0,52) (дополнительный рисунок 1H).
Рабочий процесс транскриптомики и протеомики (создан с помощью BioRender.com). Кривые динамического диапазона BD для MYH7, MYH2 и MYH1, а также рассчитанные пороговые значения для определения типа волокна. E, F Распределение экспрессии MYH по волокнам в наборах данных транскриптомики и протеомики. G, H Диаграммы равномерного приближения и проекции разнообразия (UMAP) для транскриптомики и протеомики, окрашенные в соответствии с типом волокна на основе MYH. I, J Диаграммы характеристик, показывающие экспрессию MYH7, MYH2 и MYH1 в наборах данных транскриптомики и протеомики.
Первоначально мы поставили перед собой задачу присвоить каждому волокну тип, основанный на MYH, используя оптимизированный подход, который учитывает высокую чувствительность и динамический диапазон экспрессии MYH в омиксных наборах данных. В предыдущих исследованиях использовались произвольные пороговые значения для обозначения волокон как чистого типа 1, типа 2A, типа 2X или смешанного типа на основе фиксированного процента экспрессии различных MYH11,14,24. Мы использовали другой подход, в котором экспрессия каждого волокна ранжировалась по MYH, которые мы использовали для типирования волокон: MYH7, MYH2 и MYH1, соответствующие волокнам типа 1, типа 2A и типа 2X соответственно. Затем мы математически вычислили нижнюю точку перегиба каждой полученной кривой и использовали ее в качестве порогового значения для присвоения волокнам статуса положительного (выше порога) или отрицательного (ниже порога) для каждого MYH (рисунок 1B–D). Эти данные показывают, что MYH7 (рис. 1B) и MYH2 (рис. 1C) имеют более выраженные профили экспрессии «включено/выключено» на уровне РНК по сравнению с уровнем белка. Действительно, на уровне белка очень немногие волокна не экспрессировали MYH7, и ни одно волокно не имело 100% экспрессии MYH2. Далее мы использовали заранее определенные пороговые значения экспрессии для присвоения типов волокон на основе MYH всем волокнам в каждом наборе данных. Например, волокна MYH7+/MYH2-/MYH1- были отнесены к типу 1, тогда как волокна MYH7-/MYH2+/MYH1+ были отнесены к смешанному типу 2A/2X (см. дополнительную таблицу 2 для полного описания). При объединении всех волокон мы наблюдали удивительно схожее распределение типов волокон на основе MYH как на уровне РНК (рис. 1E), так и на уровне белка (рис. 1F), в то время как относительный состав типов волокон на основе MYH варьировался у разных индивидуумов, как и ожидалось (дополнительный рисунок 2A). Большинство волокон были классифицированы как чистый тип 1 (34–35%) или тип 2A (36–38%), хотя также было обнаружено значительное количество смешанных волокон типа 2A/2X (16–19%). Заметное различие заключается в том, что чистые волокна типа 2X можно было обнаружить только на уровне РНК, но не на уровне белка, что предполагает, что быстрая экспрессия MYH, по крайней мере частично, регулируется посттранскрипционно.
Мы подтвердили эффективность нашего метода типирования волокон MYH на основе протеомики с использованием дот-блоттинга с антителами, и оба метода показали 100% совпадение в идентификации чистых волокон типа 1 и типа 2A (см. дополнительный рисунок 2B). Однако подход, основанный на протеомике, оказался более чувствительным, более эффективным в идентификации смешанных волокон и количественной оценке доли каждого гена MYH в каждом волокне. Эти данные демонстрируют эффективность использования объективного, высокочувствительного омиксного подхода для характеристики типов волокон скелетных мышц.
Затем мы использовали объединенную информацию, полученную с помощью транскриптомики и протеомики, для объективной классификации миофибрилл на основе их полного транскриптома или протеома. Используя метод равномерного приближения и проекции многообразия (UMAP) для уменьшения размерности до шести главных компонентов (дополнительные рисунки 3A–B), мы смогли визуализировать изменчивость миофибрилл в транскриптоме (рисунок 1G) и протеоме (рисунок 1H). Примечательно, что миофибриллы не были сгруппированы по участникам (дополнительные рисунки 3C–D) или дням тестирования (дополнительный рисунок 3E) ни в транскриптомных, ни в протеомных наборах данных, что предполагает, что внутрисубъектная изменчивость в скелетных мышечных волокнах выше, чем межсубъектная изменчивость. На графике UMAP выявились два отдельных кластера, представляющих «быстрые» и «медленные» миофибриллы (рисунки 1G–H). Миофибриллы MYH7+ (медленные) были сгруппированы на положительном полюсе UMAP1, тогда как миофибриллы MYH2+ и MYH1+ (быстрые) были сгруппированы на отрицательном полюсе UMAP1 (рисунки 1I–J). Однако не было выявлено различий между типами быстросокращающихся волокон (т.е. тип 2A, тип 2X или смешанный 2A/2X) на основе экспрессии MYH, что предполагает, что экспрессия MYH1 (рисунок 1I–J) или других классических маркеров миофибрилл 2X, таких как ACTN3 или MYLK2 (дополнительные рисунки 4A–B), не позволяет дифференцировать различные типы миофибрилл при рассмотрении всего транскриптома или протеома. Более того, по сравнению с MYH2 и MYH7, лишь немногие транскрипты или белки положительно коррелировали с MYH1 (дополнительные рисунки 4C–H), что предполагает, что количество MYH1 не полностью отражает транскриптом/протеом миофибрилл. Аналогичные выводы были сделаны при оценке смешанной экспрессии трех изоформ MYH на уровне UMAP (дополнительные рисунки 4I–J). Таким образом, хотя волокна 2X можно идентифицировать на уровне транскриптов на основе одной лишь количественной оценки MYH, волокна MYH1+ неотличимы от других быстрых волокон при рассмотрении всего транскриптома или протеома.
В качестве первоначального исследования гетерогенности медленных волокон, выходящей за рамки MYH, мы оценили четыре известных белка, специфичных для медленных волокон: TPM3, TNNT1, MYL3 и ATP2A22. Подтипы медленных волокон показали высокие, хотя и не идеальные, корреляции Пирсона с MYH7 как в транскриптомике (дополнительный рисунок 5A), так и в протеомике (дополнительный рисунок 5B). Приблизительно 25% и 33% медленных волокон не были классифицированы как чистые медленные волокна всеми генными/белковыми подтипами в транскриптомике (дополнительный рисунок 5C) и протеомике (дополнительный рисунок 5D) соответственно. Таким образом, классификация медленных волокон на основе множества генных/белковых подтипов вносит дополнительную сложность, даже для белков, известных как специфичные для типа волокон. Это предполагает, что классификация волокон на основе изоформ одного семейства генов/белков может неадекватно отражать истинную гетерогенность волокон скелетных мышц.
Для дальнейшего изучения фенотипической изменчивости волокон скелетных мышц человека в масштабе всей омиксной модели мы провели несмещенное снижение размерности данных с использованием анализа главных компонентов (PCA) (рис. 2A). Аналогично графикам UMAP, ни участник, ни день тестирования не влияли на кластеризацию волокон на уровне PCA (дополнительные рисунки 6A–C). В обоих наборах данных тип волокон на основе MYH объяснялся PC2, который показал кластер медленносокращающихся волокон типа 1 и второй кластер, содержащий быстросокращающиеся волокна типа 2A, типа 2X и смешанные волокна 2A/2X (рис. 2A). В обоих наборах данных эти два кластера были соединены небольшим количеством смешанных волокон типа 1/2A. Как и ожидалось, анализ избыточного представительства основных факторов PC подтвердил, что PC2 обусловлен сократительными и метаболическими сигнатурами (рис. 2B и дополнительные рисунки 6D–E, дополнительные наборы данных 5–6). В целом, было установлено, что тип волокон, основанный на MYH, достаточен для объяснения непрерывных вариаций вдоль PC2, за исключением так называемых волокон 2X, которые были распределены по всему транскриптому внутри кластера быстрых последовательностей.
A. Диаграммы анализа главных компонентов (PCA) транскриптомных и протеомных наборов данных, окрашенные в соответствии с типом волокна на основе MYH. B. Анализ обогащения драйверов транскриптов и белков в PC2 и PC1. Статистический анализ проводился с использованием пакета clusterProfiler и скорректированных p-значений Бенджамини-Хохберга. C, D. Диаграммы PCA, окрашенные в соответствии с терминами онтологии генов межклеточной адгезии (GO) в транскриптоме и костамовыми терминами GO в протеоме. Стрелки обозначают драйверы транскриптов и белков и их направления. E, F. Диаграммы признаков равномерного приближения и проекции многообразия (UMAP) клинически значимых признаков, показывающие градиенты экспрессии независимо от типа медленного/быстрого волокна. G, H. Корреляции между драйверами PC2 и PC1 в транскриптомах и протеомах.
Неожиданно, тип миофибрилл, определяемый по гену MYH, объяснил лишь вторую по величине степень изменчивости (PC2), что предполагает, что другие биологические факторы, не связанные с типом миофибрилл, определяемым по гену MYH (PC1), играют важную роль в регуляции гетерогенности волокон скелетных мышц. Анализ избыточного представительства основных факторов в PC1 показал, что изменчивость в PC1 в основном определяется межклеточной адгезией и содержанием рибосом в транскриптоме, а также костамерами и рибосомальными белками в протеоме (рисунок 2B и дополнительные рисунки 6D–E, дополнительный набор данных 7). В скелетных мышцах костамеры соединяют Z-диск с сарколеммой и участвуют в передаче силы и сигнализации. 25 Аннотированные диаграммы PCA, построенные с использованием характеристик клеточной адгезии (транскриптом, рис. 2C) и костамеров (протеом, рис. 2D), выявили сильный сдвиг влево в PC1, указывающий на то, что эти характеристики обогащены в определенных волокнах.
Более детальное исследование кластеризации миофибрилл на уровне UMAP показало, что большинство признаков демонстрируют независимый от типа миофибрилл градиент экспрессии на основе MYH, а не специфичный для субкластеров миофибрилл. Эта непрерывность наблюдалась для нескольких генов, связанных с патологическими состояниями (рис. 2E), таких как CHCHD10 (нервно-мышечное заболевание), SLIT3 (мышечная атрофия), CTDNEP1 (мышечное заболевание). Эта непрерывность также наблюдалась в протеоме, включая белки, связанные с неврологическими расстройствами (UGDH), передачей сигналов инсулина (PHIP) и транскрипцией (HIST1H2AB) (рис. 2F). В совокупности эти данные указывают на непрерывность независимой от типа волокон гетерогенности медленных/быстрых сокращений в разных миофибриллах.
Интересно, что гены-драйверы в PC2 показали хорошую корреляцию транскриптома и протеома (r = 0,663) (рис. 2G), что предполагает, что типы медленно- и быстросокращающихся волокон, и в частности сократительные и метаболические свойства волокон скелетных мышц, регулируются на транскрипционном уровне. Однако гены-драйверы в PC1 не показали корреляции транскриптома и протеома (r = -0,027) (рис. 2H), что предполагает, что вариации, не связанные с типами медленно-/быстросокращающихся волокон, в значительной степени регулируются посттранскрипционно. Поскольку вариации в PC1 в основном объяснялись терминами онтологии рибосомных генов, и учитывая, что рибосомы играют решающую и специализированную роль в клетке, активно участвуя в трансляции белков и влияя на нее,31 мы далее приступили к исследованию этой неожиданной рибосомной гетерогенности.
Сначала мы раскрасили график анализа главных компонентов протеомики в соответствии с относительным содержанием белков в термине GOCC «цитоплазматическая рибосома» (рис. 3А). Хотя этот термин обогащен на положительной стороне PC1, что приводит к небольшому градиенту, рибосомальные белки определяют распределение в обоих направлениях PC1 (рис. 3А). Рибосомальные белки, обогащенные на отрицательной стороне PC1, включали RPL18, RPS18 и RPS13 (рис. 3B), в то время как RPL31, RPL35 и RPL38 (рис. 3C) были основными факторами, определяющими распределение на положительной стороне PC1. Интересно, что RPL38 и RPS13 высоко экспрессировались в скелетных мышцах по сравнению с другими тканями (дополнительный рисунок 7А). Эти характерные рибосомальные сигнатуры в PC1 не наблюдались в транскриптоме (дополнительный рисунок 7B), что указывает на посттранскрипционную регуляцию.
A. Диаграмма анализа главных компонентов (PCA), раскрашенная в соответствии с терминами онтологии генов цитоплазматических рибосом (GO) по всему протеому. Стрелки указывают направление вариации, опосредованной белками, на диаграмме PCA. Длина линии соответствует значению главной компоненты для данного белка. B, C. Диаграммы признаков PCA для RPS13 и RPL38. D. Неконтролируемый иерархический кластерный анализ цитоплазматических рибосомальных белков. E. Структурная модель 80S рибосомы (PDB: 4V6X), выделяющая рибосомальные белки с различной концентрацией в волокнах скелетных мышц. F. Рибосомальные белки с различной стехиометрией, локализованные вблизи канала выхода мРНК.
Ранее были предложены концепции гетерогенности и специализации рибосом, согласно которым наличие различных субпопуляций рибосом (гетерогенность рибосом) может напрямую влиять на трансляцию белка в разных тканях32 и клетках33 посредством селективной трансляции специфических пулов мРНК-транскриптов34 (специализация рибосом). Для идентификации субпопуляций рибосомных белков, совместно экспрессирующихся в волокнах скелетных мышц, мы провели неконтролируемый иерархический кластерный анализ рибосомных белков в протеоме (рисунок 3D, дополнительный набор данных 8). Как и ожидалось, рибосомные белки не кластеризовались по типу волокон на основе MYH. Однако мы идентифицировали три различных кластера рибосомных белков; первый кластер (ribosomal_cluster_1) совместно регулируется с RPL38 и, следовательно, имеет повышенную экспрессию в волокнах с положительным профилем PC1. Второй кластер (рибосомальный кластер_2) координирован с RPS13 и его уровень повышается в волокнах с отрицательным профилем PC1. Третий кластер (рибосомальный кластер_3) не демонстрирует скоординированной дифференциальной экспрессии в волокнах скелетных мышц и может считаться «ядерным» рибосомальным белком скелетных мышц. Оба рибосомальных кластера 1 и 2 содержат рибосомальные белки, которые, как было показано ранее, регулируют альтернативную трансляцию (например, RPL10A, RPL38, RPS19 и RPS25) и функционально влияют на развитие (например, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 В соответствии с результатами PCA, наблюдаемое гетерогенное представление этих рибосомальных белков в разных волокнах также демонстрирует непрерывность (дополнительный рисунок 7C).
Для визуализации расположения гетерогенных рибосомальных белков внутри рибосомы мы использовали структурную модель человеческой 80S рибосомы (Банк данных белков: 4V6X) (Рисунок 3E). После выделения рибосомальных белков, принадлежащих к различным рибосомальным кластерам, их расположение не совпадало, что указывает на то, что наш подход не обеспечил обогащение определенных областей/фракций рибосомы. Интересно, однако, что доля белков большой субъединицы в кластере 2 была ниже, чем в кластерах 1 и 3 (Дополнительный рисунок 7D). Мы наблюдали, что белки с измененной стехиометрией в волокнах скелетных мышц преимущественно локализовались на поверхности рибосомы (Рисунок 3E), что согласуется с их способностью взаимодействовать с элементами внутреннего сайта инициации рибосомы (IRES) в различных популяциях мРНК, тем самым координируя селективную трансляцию. 40, 41 Более того, многие белки с измененной стехиометрией в волокнах скелетных мышц располагались вблизи функциональных областей, таких как туннель выхода мРНК (рис. 3F), которые избирательно регулируют удлинение трансляции и остановку определенных пептидов. 42 В заключение, наши данные свидетельствуют о том, что стехиометрия рибосомных белков скелетных мышц демонстрирует гетерогенность, что приводит к различиям между волокнами скелетных мышц.
Далее мы приступили к выявлению сигнатур быстро- и медленносокращающихся волокон и исследованию механизмов их транскрипционной регуляции. Сравнивая кластеры быстро- и медленносокращающихся волокон, определенные с помощью UMAP в двух наборах данных (рисунки 1G–H и 4A–B), транскриптомный и протеомный анализы выявили 1366 и 804 дифференциально экспрессируемых признака соответственно (рисунки 4A–B, дополнительные наборы данных 9–12). Мы наблюдали ожидаемые различия в сигнатурах, связанных с саркомерами (например, тропомиозин и тропонин), сопряжением возбуждения и сокращения (изоформы SERCA) и энергетическим метаболизмом (например, ALDOA и CKB). Кроме того, транскрипты и белки, регулирующие убиквитинирование белков, дифференциально экспрессировались в быстро- и медленносокращающихся волокнах (например, USP54, SH3RF2, USP28 и USP48) (рисунки 4A–B). Более того, ген микробного белка RP11-451G4.2 (DWORF), который, как было показано ранее, по-разному экспрессируется в разных типах мышечных волокон ягненка43 и усиливает активность SERCA в сердечной мышце44, был значительно повышен в медленных волокнах скелетных мышц (рис. 4А). Аналогично, на уровне отдельных волокон наблюдались значительные различия в известных сигнатурах, таких как связанные с метаболизмом изоформы лактатдегидрогеназы (LDHA и LDHB, рис. 4C и дополнительный рис. 8A)45,46, а также в ранее неизвестных сигнатурах, специфичных для типов волокон (таких как IRX3, USP54, USP28 и DPYSL3) (рис. 4C). Между транскриптомными и протеомными наборами данных наблюдалось значительное совпадение дифференциально экспрессируемых признаков (дополнительный рисунок 8B), а также корреляция изменений кратности, обусловленная главным образом более выраженной дифференциальной экспрессией признаков саркомеров (дополнительный рисунок 8C). Примечательно, что некоторые сигнатуры (например, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) демонстрировали сильную посттранскрипционную регуляцию только на протеомном уровне и имели профили экспрессии, специфичные для типов медленно/быстросокращающихся волокон (дополнительный рисунок 8C).
A и B — диаграммы типа «вулканический график», сравнивающие медленные и быстрые кластеры, идентифицированные с помощью диаграмм равномерного приближения и проекции многообразия (UMAP) на рисунках 1G–H. Цветные точки представляют транскрипты или белки, которые значительно различаются при FDR < 0,05, а более темные точки — транскрипты или белки, которые значительно различаются при логарифмическом изменении > 1. Двусторонний статистический анализ проводился с использованием теста Вальда DESeq2 с поправкой Бенджамини–Хохберга на p-значения (транскриптомика) или метода линейной модели Limma с эмпирическим байесовским анализом с последующей поправкой Бенджамини–Хохберга на множественные сравнения (протеомика). C — диаграммы сигнатур выбранных дифференциально экспрессируемых генов или белков между медленными и быстрыми волокнами. D — анализ обогащения значительно дифференциально экспрессируемых транскриптов и белков. Перекрывающиеся значения обогащены в обоих наборах данных, значения транскриптома обогащены только в транскриптоме, а значения протеома обогащены только в протеоме. Статистический анализ проводился с использованием пакета clusterProfiler с p-значениями, скорректированными по методу Бенджамини-Хохберга. E. Транскрипционные факторы, специфичные для типов волокон, идентифицированные с помощью SCENIC на основе оценок специфичности регуляторов, полученных с помощью SCENIC, и дифференциальной экспрессии мРНК между типами волокон. F. Профилирование выбранных транскрипционных факторов, дифференциально экспрессирующихся между медленными и быстрыми волокнами.
Затем мы провели анализ избыточного представительства дифференциально представленных генов и белков (Рисунок 4D, Дополнительный набор данных 13). Обогащение путей для признаков, которые различались между двумя наборами данных, выявило ожидаемые различия, такие как процессы β-окисления жирных кислот и метаболизма кетонов (медленные волокна), сокращение миофиламентов/мышц (быстрые и медленные волокна соответственно) и процессы катаболизма углеводов (быстрые волокна). Активность серин/треонин-протеинфосфатазы также была повышена в быстрых волокнах, что обусловлено такими признаками, как регуляторные и каталитические субъединицы фосфатазы (PPP3CB, PPP1R3D и PPP1R3A), которые, как известно, регулируют метаболизм гликогена (47) (Дополнительные рисунки 8D–E). Другие пути, обогащенные в быстрых волокнах, включали процессинг (P-) телец (YTHDF3, TRIM21, LSM2) в протеоме (дополнительный рис. 8F), потенциально участвующих в посттранскрипционной регуляции (48), и активность факторов транскрипции (SREBF1, RXRG, RORA) в транскриптоме (дополнительный рис. 8G). Медленные волокна были обогащены активностью оксидоредуктаз (BDH1, DCXR, TXN2) (дополнительный рис. 8H), связыванием амидов (CPTP, PFDN2, CRYAB) (дополнительный рис. 8I), внеклеточным матриксом (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (дополнительный рис. 8J) и рецепторно-лигандной активностью (FNDC5, SPX, NENF) (дополнительный рис. 8K).
Для получения более глубокого понимания транскрипционной регуляции, лежащей в основе характеристик медленных/быстрых мышечных волокон, мы провели анализ обогащения транскрипционных факторов с использованием SCENIC49 (дополнительный набор данных 14). Многие транскрипционные факторы были значительно обогащены между быстрыми и медленными мышечными волокнами (рис. 4E). Это включало такие транскрипционные факторы, как MAFA, который ранее был связан с развитием быстрых мышечных волокон,50 а также несколько транскрипционных факторов, ранее не связанных с генными программами, специфичными для типов мышечных волокон. Среди них PITX1, EGR1 и MYF6 были наиболее обогащенными транскрипционными факторами в быстрых мышечных волокнах (рис. 4E). В отличие от них, ZSCAN30 и EPAS1 (также известный как HIF2A) были наиболее обогащенными транскрипционными факторами в медленных мышечных волокнах (рис. 4E). В соответствии с этим, MAFA экспрессировался на более высоком уровне в области UMAP, соответствующей быстрым мышечным волокнам, в то время как EPAS1 имел противоположный паттерн экспрессии (рис. 4F).
Помимо известных генов, кодирующих белки, существует множество некодирующих РНК-биотипов, которые могут быть вовлечены в регуляцию развития человека и заболеваний. 51, 52 В транскриптомных наборах данных несколько некодирующих РНК демонстрируют специфичность к типу волокон (рисунок 5A и дополнительный набор данных 15), включая LINC01405, которая обладает высокой специфичностью к медленным волокнам и, как сообщается, ее уровень снижен в мышцах пациентов с митохондриальной миопатией. 53 В отличие от нее, RP11-255P5.3, соответствующая гену lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, демонстрирует специфичность к быстрому типу волокон. Как LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h), так и RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) демонстрируют специфичность для скелетных мышц (дополнительные рисунки 9A–B) и не имеют известных сократительных генов в пределах своего геномного окружения размером 1 Мб, что предполагает, что они играют специализированную роль в регуляции типов волокон, а не в регуляции соседних сократительных генов. Специфические для медленных/быстрых типов волокон профили экспрессии LINC01405 и RP11-255P5.3 были подтверждены с помощью RNAscope (рисунки 5B–C).
A. Транскрипты некодирующих РНК значительно регулируются в медленно- и быстросокращающихся мышечных волокнах. B. Репрезентативные изображения RNAscope, демонстрирующие специфичность LINC01405 и RP11-255P5.3 для медленно- и быстросокращающихся волокон соответственно. Масштабная линейка = 50 мкм. C. Количественная оценка экспрессии некодирующих РНК, специфичной для типа миофибрилл, определенная с помощью RNAscope (n = 3 биопсии от независимых лиц, сравнение быстрых и медленных мышечных волокон внутри каждого индивидуума). Статистический анализ проводился с использованием двухстороннего t-критерия Стьюдента. Диаграммы размаха показывают медиану, первый и третий квартили, а «усы» указывают на минимальное и максимальное значения. D. Рабочий процесс идентификации микробных белков de novo (создан с помощью BioRender.com). E. Микробный белок LINC01405_ORF408:17441:17358 специфически экспрессируется в медленных волокнах скелетных мышц (n=5 биопсий от независимых участников, сравнивались быстрые и медленные мышечные волокна у каждого участника). Статистический анализ проводился с использованием метода линейной модели Лимм в сочетании с эмпирическим байесовским подходом, за которым следовал метод Бенджамини-Хохберга для множественных сравнений с поправкой на p-значение. На диаграммах размаха показаны медиана, первый и третий квартили, а «усы» указывают на максимальные/минимальные значения.
Недавние исследования показали, что многие предполагаемые некодирующие транскрипты кодируют транскрибируемые микробные белки, некоторые из которых регулируют функцию мышц. 44, 55 Для идентификации микробных белков с потенциальной специфичностью к типу мышечных волокон мы провели поиск в нашем наборе данных протеома 1000 волокон, используя пользовательский файл FASTA, содержащий последовательности некодирующих транскриптов (n = 305), обнаруженных в наборе данных транскриптома 1000 волокон (рисунок 5D). Мы идентифицировали 197 микробных белков из 22 различных транскриптов, 71 из которых регулировался по-разному между медленными и быстрыми волокнами скелетных мышц (дополнительный рисунок 9C и дополнительный набор данных 16). Для LINC01405 были идентифицированы три микробных белковых продукта, один из которых показал аналогичную специфичность к медленным волокнам, как и его транскрипт (рисунок 5E и дополнительный рисунок 9D). Таким образом, мы идентифицировали LINC01405 как ген, кодирующий микробный белок, специфичный для медленных волокон скелетных мышц.
Мы разработали комплексный рабочий процесс для крупномасштабной протеомной характеристики отдельных мышечных волокон и выявили регуляторы гетерогенности волокон в здоровом состоянии. Мы применили этот рабочий процесс для понимания того, как немалиновые миопатии влияют на гетерогенность волокон скелетных мышц. Немалиновые миопатии — это наследственные заболевания мышц, вызывающие мышечную слабость и, у пораженных детей, проявляющиеся рядом осложнений, включая дыхательную недостаточность, сколиоз и ограниченную подвижность конечностей. 19,20 Как правило, при немалиновых миопатиях патогенные варианты в таких генах, как актин альфа 1 (ACTA1), приводят к преобладанию медленносокращающихся миофибрилл, хотя этот эффект неоднороден. Одним из заметных исключений является тропониновая Т1 немалиновая миопатия (TNNT1), для которой характерно преобладание быстрых волокон. Таким образом, лучшее понимание гетерогенности, лежащей в основе дисрегуляции волокон скелетных мышц, наблюдаемой при немалиновых миопатиях, может помочь раскрыть сложную взаимосвязь между этими заболеваниями и типом миофибрилл.
По сравнению со здоровыми контрольными образцами (n=3 в каждой группе), миофибриллы, выделенные у пациентов с немалиновой миопатией, имеющих мутации в генах ACTA1 и TNNT1, демонстрировали выраженную атрофию или дистрофию миофибрилл (Рисунок 6A, Дополнительная таблица 3). Это создавало значительные технические трудности для протеомного анализа из-за ограниченного количества доступного материала. Несмотря на это, нам удалось обнаружить 2485 белков в 272 скелетных миофибриллах. После фильтрации, в результате которой было отобрано не менее 1000 количественно определенных белков на волокно, 250 волокон были подвергнуты последующему биоинформатическому анализу. После фильтрации было количественно определено в среднем 1573 ± 359 белков на волокно (Дополнительный рисунок 10A, Дополнительные наборы данных 17–18). Примечательно, что, несмотря на значительное уменьшение размера волокон, глубина протеома образцов пациентов с немалиновой миопатией была лишь незначительно снижена. Более того, обработка этих данных с использованием наших собственных файлов FASTA (включая некодирующие транскрипты) позволила нам идентифицировать пять микробных белков в скелетных миофибриллах пациентов с немалиновой миопатией (дополнительный набор данных 19). Динамический диапазон протеома был значительно шире, а общее количество белков в контрольной группе хорошо коррелировало с результатами предыдущего анализа протеома 1000 волокон (дополнительный рисунок 10B–C).
A. Микроскопические изображения, демонстрирующие атрофию или дистрофию волокон и преобладание различных типов волокон в зависимости от MYH при немалиновых миопатиях ACTA1 и TNNT1 (НМ). Масштабная линейка = 100 мкм. Для обеспечения воспроизводимости окрашивания у пациентов с ACTA1 и TNNT1 три биопсии пациентов были окрашены два-три раза (четыре среза на случай) перед выбором репрезентативных изображений. B. Доля типов волокон у участников в зависимости от MYH. C. Диаграмма анализа главных компонентов (PCA) скелетных мышечных волокон у пациентов с немалиновыми миопатиями и контрольной группы. D. Скелетные мышечные волокна пациентов с немалиновыми миопатиями и контрольной группы, спроецированные на диаграмму PCA, определенную на основе 1000 волокон, проанализированных на рисунке 2. Например, диаграммы типа «вулкан», сравнивающие различия между участниками с немалиновыми миопатиями ACTA1 и TNNT1 и контрольной группой, а также между участниками с немалиновыми миопатиями ACTA1 и TNNT1. Цветные круги обозначают белки, различия между которыми были статистически значимыми при π < 0,05, а темные точки — белки, различия между которыми были статистически значимыми при FDR < 0,05. Статистический анализ проводился с использованием метода линейной модели Limma и эмпирических байесовских методов, с последующей корректировкой p-значений для множественных сравнений с использованием метода Бенджамини-Хохберга. H. Анализ обогащения белков со значительной дифференциальной экспрессией по всему протеому и в волокнах типа 1 и 2A. Статистический анализ проводился с использованием пакета clusterProfiler и скорректированных p-значений Бенджамини-Хохберга. I, J. Диаграммы анализа главных компонентов (PCA), окрашенные по терминам онтологии генов внеклеточного матрикса и митохондрий (GO).
Поскольку немалиновые миопатии могут влиять на долю типов миофибрилл, экспрессирующих MYH, в скелетных мышцах19,20, мы сначала исследовали типы миофибрилл, экспрессирующих MYH, у пациентов с немалиновыми миопатиями и в контрольной группе. Мы определяли тип миофибрилл, используя непредвзятый метод, ранее описанный для анализа 1000 миофибрилл (дополнительные рисунки 10D–E), и снова не смогли идентифицировать чистые миофибриллы 2X (рисунок 6B). Мы наблюдали гетерогенное влияние немалиновых миопатий на тип миофибрилл, поскольку у двух пациентов с мутациями ACTA1 наблюдалось увеличение доли миофибрилл типа 1, тогда как у двух пациентов с немалиновой миопатией TNNT1 наблюдалось уменьшение доли миофибрилл типа 1 (рисунок 6B). Действительно, экспрессия MYH2 и быстрых изоформ тропонина (TNNC2, TNNI2 и TNNT3) была снижена при немалиновых миопатиях ACTA1, тогда как экспрессия MYH7 была снижена при немалиновых миопатиях TNNT1 (дополнительный рисунок 11A). Это согласуется с предыдущими сообщениями о гетерогенном переключении типов миофибрилл при немалиновых миопатиях.19,20 Мы подтвердили эти результаты с помощью иммуногистохимии и обнаружили, что у пациентов с немалиновой миопатией ACTA1 преобладали миофибриллы типа 1, тогда как у пациентов с немалиновой миопатией TNNT1 наблюдалась противоположная картина (рисунок 6A).
На уровне протеома отдельных волокон скелетные мышечные волокна пациентов с немалиновой миопатией ACTA1 и TNNT1 группировались с большинством контрольных волокон, при этом волокна пациентов с немалиновой миопатией TNNT1, как правило, были наиболее сильно поражены (Рисунок 6C). Это было особенно очевидно при построении графиков анализа главных компонентов (PCA) псевдо-раздутых волокон для каждого пациента, при этом пациенты с немалиновой миопатией TNNT1 2 и 3 оказались наиболее удаленными от контрольных образцов (Дополнительный рисунок 11B, Дополнительный набор данных 20). Чтобы лучше понять, как волокна пациентов с миопатией соотносятся со здоровыми волокнами, мы использовали подробную информацию, полученную в результате протеомного анализа 1000 волокон от здоровых взрослых участников. Мы спроецировали волокна из набора данных по миопатии (пациенты с немалиновой миопатией ACTA1 и TNNT1 и контрольная группа) на график PCA, полученный в результате протеомного анализа 1000 волокон (Рисунок 6D). Распределение типов волокон MYH вдоль PC2 в контрольных волокнах было аналогично распределению волокон, полученному в результате протеомного анализа 1000 волокон. Однако большинство волокон у пациентов с немалиновой миопатией смещались вниз по PC2, перекрываясь со здоровыми быстросокращающимися волокнами, независимо от их исходного типа волокон MYH. Таким образом, хотя у пациентов с немалиновой миопатией ACTA1 наблюдалось смещение в сторону волокон типа 1 при количественной оценке с использованием методов, основанных на MYH, как немалиновая миопатия ACTA1, так и немалиновая миопатия TNNT1 смещали протеом скелетных мышечных волокон в сторону быстросокращающихся волокон.
Затем мы напрямую сравнили каждую группу пациентов со здоровыми контрольными группами и выявили 256 и 552 дифференциально экспрессируемых белка при немалиновой миопатии ACTA1 и TNNT1 соответственно (рисунок 6E–G и дополнительный рисунок 11C, дополнительный набор данных 21). Анализ обогащения генов выявил скоординированное снижение уровня митохондриальных белков (рисунок 6H–I, дополнительный набор данных 22). Удивительно, но, несмотря на дифференциальное преобладание типов волокон при немалиновой миопатии ACTA1 и TNNT1, это снижение было полностью независимым от типа волокон на основе MYH (рисунок 6H и дополнительные рисунки 11D–I, дополнительный набор данных 23). Три микробных белка также регулировались при немалиновой миопатии ACTA1 или TNNT1. Два из этих микропротеинов, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (также известный как LINC00598 или Lnc-FOXO1) и ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), показали дифференциальную концентрацию только в миофибриллах типа 1. Ранее сообщалось, что ENSG00000215483_TR14_ORF67 играет роль в регуляции клеточного цикла. 56 С другой стороны, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (соответствующий LINC01798) был повышен как в миофибриллах типа 1, так и в миофибриллах типа 2A при ACTA1-немалиновой миопатии по сравнению со здоровыми контрольными образцами (дополнительный рисунок 12A, дополнительный набор данных 24). Напротив, рибосомальные белки практически не изменялись при немалиновой миопатии, хотя экспрессия RPS17 снижалась при немалиновой миопатии ACTA1 (рис. 6E).
Анализ обогащения также выявил усиление процессов иммунной системы при немалиновой миопатии ACTA1 и TNNT1, а также увеличение клеточной адгезии при немалиновой миопатии TNNT1 (рис. 6H). Обогащение этими внеклеточными факторами отразилось в смещении PCA в PC1 и PC2 в отрицательном направлении (т.е., в сторону наиболее пораженных волокон) белками внеклеточного матрикса (рис. 6J). Обе группы пациентов показали повышенную экспрессию внеклеточных белков, участвующих в иммунных ответах и ​​механизмах восстановления сарколеммы, таких как аннексины (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 и взаимодействующий с ними белок S100A1159 (дополнительные рисунки 12B–C). Ранее сообщалось об усилении этого процесса при мышечных дистрофиях60, но, насколько нам известно, ранее он не был связан с немалиновой миопатией. Нормальное функционирование этого молекулярного механизма необходимо для восстановления сарколеммы после травмы и для слияния новообразованных миоцитов с миофибриллами58,61. Таким образом, повышенная активность этого процесса в обеих группах пациентов предполагает репаративный ответ на травму, вызванную нестабильностью миофибрилл.
Эффекты каждой из немалиновых миопатий хорошо коррелировали (r = 0,736) и демонстрировали разумное перекрытие (дополнительные рисунки 11A–B), что указывает на сходное влияние немалиновых миопатий ACTA1 и TNNT1 на протеом. Однако некоторые белки регулировались только при немалиновой миопатии ACTA1 или TNNT1 (дополнительные рисунки 11A и C). Профибротический белок MFAP4 был одним из наиболее повышенно экспрессируемых белков при немалиновой миопатии TNNT1, но оставался неизменным при немалиновой миопатии ACTA1. SKIC8, компонент комплекса PAF1C, ответственный за регуляцию транскрипции генов HOX, был снижен при немалиновой миопатии TNNT1, но не был затронут при немалиновой миопатии ACTA1 (дополнительный рисунок 11A). Прямое сравнение немалиновой миопатии ACTA1 и TNNT1 выявило большее снижение митохондриальных белков и увеличение белков иммунной системы при немалиновой миопатии TNNT1 (рисунок 6G–H и дополнительные рисунки 11C и 11H–I). Эти данные согласуются с большей атрофией/дистрофией, наблюдаемой при немалиновой миопатии TNNT1 по сравнению с немалиновой миопатией TNNT1 (рисунок 6A), что позволяет предположить, что немалиновая миопатия TNNT1 представляет собой более тяжелую форму заболевания.
Чтобы оценить, сохраняются ли наблюдаемые эффекты немалиновой миопатии на уровне всей мышцы, мы провели массовый протеомный анализ биопсий мышц из той же когорты пациентов с немалиновой миопатией TNNT1 и сравнили их с контрольной группой (n=3 в каждой группе) (дополнительный рис. 13A, дополнительный набор данных 25). Как и ожидалось, контрольная группа показала тесную взаимосвязь в анализе главных компонентов, тогда как у пациентов с немалиновой миопатией TNNT1 наблюдалась более высокая межвыборочная вариабельность, аналогичная той, что была выявлена ​​при анализе отдельных волокон (дополнительный рис. 13B). Массовый анализ воспроизвел дифференциально экспрессируемые белки (дополнительный рис. 13C, дополнительный набор данных 26) и биологические процессы (дополнительный рис. 13D, дополнительный набор данных 27), выявленные при сравнении отдельных волокон, но потерял способность различать разные типы волокон и не смог учесть гетерогенные эффекты заболевания в разных волокнах.
В совокупности эти данные демонстрируют, что протеомика отдельных миофибрилл может выявить клинические биологические особенности, которые невозможно обнаружить с помощью целевых методов, таких как иммуноблоттинг. Более того, эти данные подчеркивают ограничения использования только типирования актиновых волокон (MYH) для описания фенотипической адаптации. Действительно, хотя переключение типов волокон различается между актиновыми и тропониновыми немалиновыми миопатиями, обе немалиновые миопатии отрывают типирование волокон MYH от метаболизма скелетных мышечных волокон в сторону более быстрого и менее окислительного мышечного протеома.
Клеточная гетерогенность имеет решающее значение для удовлетворения разнообразных потребностей тканей. В скелетных мышцах это часто описывается как типы волокон, характеризующиеся различной степенью развития силы и утомляемости. Однако очевидно, что это объясняет лишь небольшую часть изменчивости волокон скелетных мышц, которая гораздо более изменчива, сложна и многогранна, чем считалось ранее. Технологические достижения пролили свет на факторы, регулирующие волокна скелетных мышц. Действительно, наши данные предполагают, что волокна типа 2X могут не являться отдельным подтипом волокон скелетных мышц. Более того, мы идентифицировали метаболические белки, рибосомальные белки и клеточно-ассоциированные белки как основные детерминанты гетерогенности волокон скелетных мышц. Применив наш протеомный метод к образцам пациентов с нематодной миопатией, мы дополнительно продемонстрировали, что типирование волокон на основе MYH не полностью отражает гетерогенность скелетных мышц, особенно когда система нарушена. Действительно, независимо от типа волокон, основанных на MYH, миопатия, вызванная нематодами, приводит к смещению в сторону более быстрых и менее окислительных волокон.
Классификация скелетных мышечных волокон началась еще в XIX веке. Недавние омикс-анализы позволили нам начать понимать профили экспрессии различных типов MYH-волокон и их реакцию на различные стимулы. Как описано здесь, омикс-подходы также обладают преимуществом большей чувствительности при количественной оценке маркеров типов волокон, чем традиционные методы, основанные на антителах, без необходимости полагаться на количественную оценку одного (или нескольких) маркеров для определения типа скелетного мышечного волокна. Мы использовали дополнительные транскриптомные и протеомные методы и интегрировали результаты для изучения транскрипционной и посттранскрипционной регуляции гетерогенности волокон в скелетных мышечных волокнах человека. Этот метод не позволил идентифицировать чистые волокна типа 2X на белковом уровне в латеральной широкой мышце бедра нашей когорты здоровых молодых мужчин. Это согласуется с предыдущими исследованиями отдельных волокон, которые обнаружили менее 1% чистых волокон типа 2X в здоровой латеральной широкой мышце бедра, хотя это следует подтвердить в других мышцах в будущем. Несоответствие между обнаружением почти чистых волокон 2X на уровне мРНК и наличием только смешанных волокон 2A/2X на белковом уровне вызывает недоумение. Экспрессия мРНК изоформ MYH не является циркадной,67 что предполагает, что мы вряд ли «пропустили» сигнал начала экспрессии MYH2 в, казалось бы, чистых волокнах 2X на уровне РНК. Одно из возможных объяснений, хотя и чисто гипотетическое, может заключаться в различиях в стабильности белка и/или мРНК между изоформами MYH. Действительно, ни одно быстрое мышечное волокно не является на 100% чистым для какой-либо изоформы MYH, и неясно, приведет ли уровень экспрессии мРНК MYH1 в диапазоне 70–90% к равному содержанию MYH1 и MYH2 на белковом уровне. Однако, рассматривая весь транскриптом или протеом, кластерный анализ может с уверенностью идентифицировать только два отдельных кластера, представляющих медленные и быстрые волокна скелетных мышц, независимо от их точного состава MYH. Это согласуется с анализами, использующими транскриптомные подходы на уровне отдельных ядер, которые обычно идентифицируют только два различных кластера миоядер. 68, 69, 70 Более того, хотя предыдущие протеомные исследования идентифицировали волокна типа 2X, эти волокна не образуют отдельный кластер от остальных быстрых волокон и демонстрируют лишь небольшое количество белков с дифференциальной экспрессией по сравнению с другими типами волокон на основе MYH. 14 Эти результаты предполагают, что нам следует вернуться к взгляду начала 20-го века на классификацию мышечных волокон, который делил волокна скелетных мышц человека не на три отдельных класса на основе MYH, а на два кластера на основе их метаболических и сократительных свойств. 63
Что еще более важно, гетерогенность миофибрилл следует рассматривать в нескольких измерениях. Предыдущие «омиксные» исследования указывали на это направление, предполагая, что волокна скелетных мышц не образуют дискретных кластеров, а расположены вдоль континуума. 11, 13, 14, 64, 71 Здесь мы показываем, что, помимо различий в сократительных и метаболических свойствах скелетных мышц, миофибриллы могут быть дифференцированы по признакам, связанным с межклеточными взаимодействиями и механизмами трансляции. Действительно, мы обнаружили гетерогенность рибосом в волокнах скелетных мышц, которая вносит вклад в гетерогенность независимо от типа медленных и быстрых волокон. Основная причина этой существенной гетерогенности миофибрилл, независимо от типа медленных и быстрых волокон, остается неясной, но она может указывать на специализированную пространственную организацию внутри мышечных пучков, которые оптимально реагируют на определенные силы и нагрузки72, специализированную клеточную или органоспецифическую коммуникацию с другими типами клеток в микроокружении мышц73,74,75 или различия в активности рибосом внутри отдельных миофибрилл. Действительно, было показано, что гетероплазмия рибосом, либо посредством паралогической замены RPL3 и RPL3L, либо на уровне 2'-O-метилирования рРНК, связана с гипертрофией скелетных мышц76,77. Мультиомические и пространственные приложения в сочетании с функциональной характеристикой отдельных миофибрилл позволят еще больше углубить наше понимание биологии мышц на мультиомическом уровне78.
Анализируя протеомы отдельных миофибрилл у пациентов с немелиновыми миопатиями, мы также продемонстрировали полезность, эффективность и применимость протеомики отдельных миофибрилл для выяснения клинической патофизиологии скелетных мышц. Более того, сравнивая наш рабочий процесс с глобальным протеомным анализом, мы смогли показать, что протеомика отдельных миофибрилл дает ту же глубину информации, что и глобальная протеомика тканей, и расширяет эту глубину за счет учета межволоконной гетерогенности и типа миофибрилл. В дополнение к ожидаемым (хотя и вариабельным) различиям в соотношении типов волокон, наблюдаемым при немелиновых миопатиях ACTA1 и TNNT1 по сравнению со здоровыми контрольными группами,19 мы также наблюдали окислительное и внеклеточное ремоделирование, независимое от опосредованного MYH переключения типов волокон. Ранее сообщалось о фиброзе при немалиновых миопатиях TNNT1.¹⁹ Однако наш анализ дополняет это открытие, выявляя также повышенные уровни внеклеточных секретируемых стресс-связанных белков, таких как аннексины, участвующих в механизмах восстановления сарколеммы, в миофибриллах пациентов с немалиновыми миопатиями ACTA1 и TNNT1.^57,58,59 В заключение, повышенные уровни аннексинов в миофибриллах пациентов с немалиновой миопатией могут представлять собой клеточный ответ, направленный на восстановление сильно атрофированных миофибрилл.
Хотя данное исследование представляет собой крупнейший на сегодняшний день анализ омиксных данных целых мышц человека с использованием отдельных волокон, оно не лишено ограничений. Мы выделили волокна скелетных мышц из относительно небольшой и однородной выборки участников и одной мышцы (латеральной широкой мышцы бедра). Поэтому невозможно исключить существование специфических популяций волокон в разных типах мышц и при крайних значениях физиологии мышц. Например, мы не можем исключить возможность появления подмножества сверхбыстрых волокон (например, чистых волокон 2X) у высококвалифицированных спринтеров и/или силовых атлетов79 или в периоды мышечной неактивности66,80. Кроме того, ограниченный размер выборки участников не позволил нам исследовать половые различия в гетерогенности волокон, поскольку известно, что соотношение типов волокон различается у мужчин и женщин. Более того, мы не смогли провести транскриптомный и протеомный анализ одних и тех же мышечных волокон или образцов от одних и тех же участников. Поскольку мы и другие исследователи продолжаем оптимизировать анализ отдельных клеток и миофибрилл с использованием омикс-анализа для достижения сверхнизкого объема образца (как показано здесь на примере анализа волокон пациентов с митохондриальной миопатией), становится очевидной возможность объединения мультиомиксных (и функциональных) подходов в рамках анализа отдельных мышечных волокон.
В целом, наши данные выявляют и объясняют транскрипционные и посттранскрипционные факторы, определяющие гетерогенность скелетных мышц. В частности, мы представляем данные, которые ставят под сомнение давнюю догму в физиологии скелетных мышц, связанную с классическим определением типов волокон на основе гена MYH. Мы надеемся возобновить дискуссию и в конечном итоге переосмыслить наше понимание классификации и гетерогенности волокон скелетных мышц.
В исследовании добровольно приняли участие четырнадцать участников европеоидной расы (12 мужчин и 2 женщины). Исследование было одобрено Комитетом по этике университетской больницы Гента (BC-10237), соответствовало Хельсинкской декларации 2013 года и было зарегистрировано на ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Общие характеристики участников представлены в дополнительной таблице 1. После получения устного и письменного информированного согласия участники прошли медицинское обследование перед окончательным включением в исследование. Участники были молодыми (22–42 года), здоровыми (без заболеваний, без истории курения) и умеренно физически активными. Максимальное потребление кислорода определялось с помощью степпера для оценки физической подготовленности, как описано ранее. 81
Образцы мышечной биопсии собирали в состоянии покоя и натощак трижды с интервалом в 14 дней. Поскольку эти образцы собирались в рамках более крупного исследования, участники принимали плацебо (лактозу), антагонист H1-рецепторов (540 мг фексофенадина) или антагонист H2-рецепторов (40 мг фамотидина) за 40 минут до биопсии. Ранее мы продемонстрировали, что эти антагонисты гистаминовых рецепторов не влияют на физическую форму скелетных мышц в состоянии покоя81, и на наших графиках контроля качества не наблюдалось кластеризации, связанной с состоянием (дополнительные рисунки 3 и 6). Стандартизированная диета (41,4 ккал/кг массы тела, 5,1 г/кг массы тела углеводов, 1,4 г/кг массы тела белка и 1,6 г/кг массы тела жира) поддерживалась в течение 48 часов перед каждым экспериментальным днем, а стандартизированный завтрак (1,5 г/кг массы тела углеводов) употреблялся утром в экспериментальный день. Под местной анестезией (0,5 мл 1% лидокаина без адреналина) биопсию латеральной широкой мышцы бедра брали с помощью чрескожной аспирации по Бергстрёму.82 Образцы мышц немедленно помещали в раствор RNAlater и хранили при 4°C до ручного выделения волокон (до 3 дней).
Свежевыделенные пучки миофибрилл переносили в свежую среду RNAlater в чашку Петри. Затем отдельные миофибриллы вручную выделяли с помощью стереомикроскопа и тонких пинцетов. Из каждой биопсии выделяли по 25 волокон, уделяя особое внимание отбору волокон из разных участков биопсии. После выделения каждое волокно осторожно погружали в 3 мкл лизирующего буфера (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad), содержащего протеиназу K и ДНКазу, для удаления нежелательных белков и ДНК. Затем начинали лизис клеток и удаление белков/ДНК путем кратковременного перемешивания на вортексе, центрифугирования жидкости в микроцентрифуге и инкубации при комнатной температуре (10 мин). Затем лизат инкубировали в термоциклере (T100, Bio-Rad) при 37°C в течение 5 мин, при 75°C в течение 5 мин, после чего немедленно хранили при -80°C до дальнейшей обработки.
Совместимые с Illumina библиотеки полиаденилированной РНК были подготовлены из 2 мкл лизата миофибрилл с использованием набора для подготовки библиотек QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq (Lexogen). Подробные методы описаны в руководстве производителя. Процесс начинается с синтеза первой цепи кДНК методом обратной транскрипции, в ходе которого вводятся уникальные молекулярные идентификаторы (UMI) и специфические для образцов i1-штрихкоды для обеспечения объединения образцов и снижения технической вариабельности в процессе последующей обработки. Затем кДНК из 96 миофибрилл объединяется и очищается с помощью магнитных шариков, после чего удаляется РНК и выполняется синтез второй цепи с использованием случайных праймеров. Библиотека очищается с помощью магнитных шариков, добавляются специфические для пула i5/i7-метки и проводится ПЦР-амплификация. Заключительный этап очистки позволяет получить совместимые с Illumina библиотеки. Качество каждой библиотеки оценивалось с использованием набора для высокочувствительного анализа малых фрагментов ДНК (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
На основании количественного анализа с помощью Qubit, образцы были дополнительно объединены в эквимолярных концентрациях (2 нМ). Полученный пул затем секвенировали на приборе NovaSeq 6000 в стандартном режиме с использованием набора реагентов NovaSeq S2 (1 × 100 нуклеотидов) с загрузкой 2 нМ (4% PhiX).
Наш конвейер обработки данных основан на конвейере анализа данных QuantSeq Pool от Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Сначала данные были демультиплексированы с помощью bcl2fastq2 (v2.20.0) на основе индекса i7/i5. Затем рид 2 был демультиплексирован с помощью idemux (v0.1.6) на основе штрихкода образца i1, а последовательности UMI были извлечены с помощью umi_tools (v1.0.1). Затем риды были обрезаны с помощью cutadapt (v3.4) в несколько этапов для удаления коротких ридов (<20 нуклеотидов в длину) или ридов, состоящих исключительно из адаптерных последовательностей. Затем риды были выровнены по геному человека с помощью STAR (v2.6.0c), а BAM-файлы были проиндексированы с помощью SAMtools (v1.11). Дублирующиеся риды были удалены с помощью umi_tools (v1.0.1). Наконец, подсчет выравниваний был выполнен с использованием featureCounts в Subread (v2.0.3). Контроль качества проводился с помощью FastQC (v0.11.9) на нескольких промежуточных этапах конвейера.
Вся дальнейшая биоинформатическая обработка и визуализация проводились в R (v4.2.3), в основном с использованием рабочего процесса Seurat (v4.4.0). 83 Таким образом, индивидуальные значения UMI и матрицы метаданных были преобразованы в объекты Seurat. Гены, экспрессирующиеся менее чем в 30% всех волокон, были удалены. Образцы низкого качества были удалены на основе минимального порогового значения в 1000 значений UMI и 1000 обнаруженных генов. В конечном итоге 925 волокон прошли все этапы фильтрации контроля качества. Значения UMI были нормализованы с использованием метода Seurat SCTransform v2, 84 включая все 7418 обнаруженных признаков, а различия между участниками были исключены с помощью регрессионного анализа. Все соответствующие метаданные можно найти в дополнительном наборе данных 28.